הדמיה חיה של מוות תאי מקרופאג במהלך זיהום מיקובקטריאלי בעוברי דגי זברה

תקציר

מקור: ניו, ל. ואחרים. הדמיה של מוות תאי ליז של מקרופאגים במהלך זיהום מיקובקטריאלי בעוברי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופיה תוך-חיונית. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית תוך-חיונית כדי להמחיש מוות תאי ליז של מקרופאגים בעוברי דגי זברה לאחר זיהום Mycobacterium marinum .

פרוטוקול

1. הדמיה חיה של הזיהום

1. 1. התקנת דגים להדמיה חיה
   1. העבירו עד 10 עוברים מונדים בטריקאין לאמצע צלחת זכוכית בעובי 35 מ"מ. תוותר על תוספת E3 בינונית.
   2. כסו את הצלחת באגרוז של 1% עם נקודת התכה נמוכה ומכוונים בזהירות את עוברי דגי הזברה באמצעות מחט של 10 גרם. דגרו את תחתית הזכוכית על קרח במשך 10 שניות כדי להציק את האגרוז.
      הערה: להזרקת מוח ביניים, יש להתקין עוברים באגרוז כאשר הראש מופנה כלפי מעלה (איור 1A).
   3. לאחר שהאגרוז התקשה לחלוטין, כסה את האגרוז בשכבת מי ביצה (ועוד 1 טריקאין ו-PTU (N-פנילתיאוראה)).
2. מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה בשלושה צבעים
   הערה: השלבים הבאים מופעלים במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בעדשת UV שמן 63.0x1.40.
   1. כוונו את טמפרטורת התא הסביבתי ל-28.5 מעלות צלזיוס. הניחו נייר טישו רטוב בתוך התא כדי לספק לחות ולמנוע אידוי של מי הביצה.
   2. הניחו את תבנית הזכוכית באורך 35 מ"מ עם דג הזברה בתא הסביבתי.
   3. פתח את תוכנת הקונפוקל ואתחל את הבמה. עבור לאובייקט UV שמן בגודל 63.0 x 1.40 ואתר את דג הזברה באמצעות תעלת השדה הבהיר עם מסנן קונטרסט הפרעות דיפרנציאלי (DIC).
   4. פתח את הדיודה 405, ארגון (20% כוח), ולייזר DPSS 561 ננומטר. הגדר את הגדרות הספק והספקטרום המתאימות.
      הערה: להלן הגדרות הספקטרום עבור סרוליאן (עירור = 405 ננומטר; פליטה = ~456–499 ננומטר), eGFP (עירור = 488 ננומטר; פליטה = ~500–550 ננומטר), DsRed2 (עירור = 561 ננומטר; פליטה = ~575–645 ננומטר)
   5. בחר במצב רכישה "XYZ" "סריקה רציפה" והגדר את פורמט התמונה ל"512 x 512 פיקסלים".
   6. עבור ל"מצב נתונים חיים". כוון את מיקום דג הזברה הראשון וסמן את מיקום ה-Z "התחל" ו"סיום". חזור על התהליך הזה עבור כל אחד מהעוברים שנותרו. ניתן להוסיף "הפסקה" בסוף התוכנית.
   7. הגדר את הלולאה והמחזור של התוכנית.
   8. שמור את הקובץ.

תוצאות

איור 1: הרכבת עוברים של דגי זברה להדמיה חיה. (א) לזיהום במוח התיכון, עוברי דגי זברה הותקנו עם ראשיהם כלפי מטה. (B) לזיהום באזור הגוף, עוברי דגי הזברה הותקנו לרוחב עם אתר ההזרקה קרוב לתחתית צלחת הזכוכי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ	In Vitro Scientific	D35-10-0-N
אגרוז	סאנגון ביוטק	A60015
מיקרוסקופ קונפוקלי	לייקה	TCS SP5 II
החדר הסביבתי	פקון	בקרת טמפרטורה 37-2 דיגיטלית
מיקובקטריום מרינום			ATCC BAA-535
N-פנילתיאוראה (PTU)	סיגמא	P7629