הערכה במבחנה של הרג חיידקים על ידי פגוציטים של טחול בעכבר יילוד

תקציר

מקור: סמאן, ב. ג., et.al. מודל הדמיה של אלח דם חיידקי גראם שלילי. J. Vis. Exp. (2020)

הסרטון הזה מדגים את הבידוד של נויטרופילים ומונוציטים דלקתיים מטחול עכבר יילוד ואת יישומם במבחן הרג חיידקים זוהר. הוא עוסק בדיסוציאציה מכנית, פירוק תאי דם אדומים, העשרת תאים מבוססת חרוזים מגנטיים, דגירה חיידקית והגנה אנטיביוטית. קריאות זוהר מתוזמנות מצביעות על הפנמת חיידקים ראשונית ואחריה ניקוי מתווך חיסוני.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הבחינה האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. מבחן הרג חיידקים חוץ גופני

1. הסירו את הטחול מגור תינוק לא נגוע והניחו אותו בסל ניילון בנפח 40 מיקרון בתוך צלחת פטרי סטרילית בקוטר 60 מ"מ. חזור על כך ואגד את הטחול בצינור אחד כדי להיקטף ולהומזום יחד.
2. הוסיפו 5 מ"ל של מי מלח עם בופר פוספט (PBS) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS).
3. פירקו את הרקמה באמצעות בומפה סטרילית של מזרק בנפח 3 מ"ל עד שנוצר תליית תא יחיד.
4. אסוף את המתלה החד-תאי מחוץ לסל הניילון, העבר לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, ותאי פלט ב-350 x גרם למשך 5 דקות.
5. השאירו את התאים בבופר פירוק תאי דם אדומים (2 מ"ל עד 7-8 טחולים) והניחו להם לעמוד 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לסלק את האריתרוציטים.
6. שטוף טחולים עם PBS ופלטים כפי שציינתי קודם.
7. השהיי את הטחולים ב-0.25 מ"ל של PBS עם תוספת של 0.5% BSA ו-2 mM EDTA בהתאם לתפוקת התאים הצפויה.
8. ספירת הטחולים באמצעות המוסיטומומטר או יישום מתאים אחר.
9. בידוד תאי Ly6B.2⁺ (אוכלוסיית המיאלואידים של גרנולוציטים/מונוציטים דלקתיים) עם חרוזים אימונומגנטיים.
10. תאי זרע Ly6B.2⁺ בצפיפות של 1 x 10⁵ תאים לבאר בלוח שחור או לבן של 96 בארות בנפח של 0.1 מ"ל DMEM המכיל 10% FBS, 2 mM גלוטמין ו-25 mM HEPES (מדיום שלם).
11. יש למנות את E. coli ביולומינסנטי ולהכין את החיסון בכמות ההדבקה הרצויה (MOI) בנפח סופי של 0.1 מ"ל. הכי טוב לעשות זאת על ידי יצירת מה שנדרש לכל הבארות ב-MOI משותף באצווה.
12. הוסף 0.1 מ"ל של חיסון חיידקי או מדיום שלם בלבד כאמצעי ביקורת. דגור את לוח הבארות המרובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%_CO2 למשך שעה.
13. החלף את המדיה ב-0.2 מ"ל של מדיה שלמה טרייה שמכילה גנטמצין (100 מיקרוגרם/מ"ל) על ידי הסרת מדיה עדינה עם פיפטה והוספת מדיה טרייה עם קצה פיפטה חדש. החזר את התרבית לדגירה לעוד שעתיים.
14. ב-3 שעות לאחר ההדבקה, מדדו את הזוהר בכל באר של לוח התרבית המכוסה מהתחתית באמצעות קורא לוחות ואז החזרו את התרבית לדגירה.
15. מדידות חוזרות של זוהר בנקודות זמן רצויות אחרות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מאגר ACK Lysis	גיבקו	LSA1049201	בדיקת ניקוי חיידקים
מיקרו-חרוזי אנטי-Ly-6B.2	מילטני ביוטק	130-100-781	בידוד תאים
אשריכיה קולי O1:K1:H7-lux (מבטא לוסיפראז)	לא זמין	לא זמין	נבנה פנימית ב-WVU
בופר בידוד	מילטני ביוטק	לא זמין	בדיקת ניקוי חיידקים
LB Broth, לנוקס	פישר ביוריאגנטים	BP1427-500	צמיחת חיידקים
מסננת EASYs (סל ניילון)	גריינר ביו-וואן	542 040	מסננת תאים
ספקטרמקס iD3	מכשירים מולקולריים	לא זמין	קורא לוחות