כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים המוסדית המקומית וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. הכנת חיסון חיידקי
- רצף פלטת אגר סויה טריפטית (TSA) עם לולאת חיסון לבידוד מושבה בודדת ממלאי מקפיא של Escherichia coli O1:K1:H7-lux , שמבטא לוסיפראז באופן יציב ונושא עמידות לקאנאמיצין. דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- למחרת, אפשר למרק לוריה (LB) להגיע לטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) בארון בטיחות ביולוגית.
- מתחת למכסה ארון בטיחות ביולוגית, יש לזהות מושבה אחת מהפלטה המפוספסת ולהחסין אותה ב-3 מ"ל LB בתוספת קאנמיצין (30 מיקרוגרם/מ"ל). דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור במהירות של 220 סיבובים לדקה (סל"ד). זו תרבות ההתחלה.
- מדלל את תרבית ההתחלה ב-1:100 ל-3 מ"ל LB טרי מתחת למכסה תא ביו-בטיחות והחזר אותו לאינקובטור למשך 2-3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור (220 סל"ד). זו תרבות המלאי.
- קרא את הצפיפות האופטית (OD) של התרבות הרקה והסטוק ב-600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. הוסף 100 מיקרולטר LB (שאינו מכיל חיידקים) לבאר אחת של לוח בדיקה שטוח-תחתית עם 96 בארות; זה הריק. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר מתרבות המאגר לבאר נפרדת. חזור על זה לשני שכפולים נוספים. הספיגה נקראת באמצעות קורא לוחות.
- הפחת את הספיגה הריקה מערך הספיגה של תרבית המלאי (ערך ה-OD) והשווה לעקומת גדילה שנוצרה ואומתה קודם לכן כדי לקבוע הערכה של צפיפות החיידקים בתרבות המלאי להכנת המינון המדבק.
- יצר חיסון מטרה בהתאם לשאלת המחקר. חיסון מטרה של 2 x 10⁶ (נמוך) ו-7 x 10⁶ (גבוה) יחידות יצירת מושבות (CFUs) לכל עכבר (/עכבר) שימש למחקר זה.
- חלק את המינון היעד לכל עכבר (DoseT) בריכוז המשוער של חיידקים בתרבות המלאי (Stock) כדי לקבל את נפח החיידקים הנדרש מצינור המלאי (VS).
- הכפל את VS במספר העכברים (NM) שצריך להידבק, יחד עם מספיק ל-5-10 מנות נוספות, עבור כמות החיידקים הכוללת הנדרשת לזיהום, ועוד 5-10 מנות נוספות. הסר את הנפח הזה מהצינור המקורי והוסף אותו לצינור צנטריפוגה חדש.
- השתמש במשוואה למטה: DoseT/Stock = VS x NM = נפח כולל (VT) של חיידקים שיש להסיר מצינור המלאי.
- צנטריפוגה את החיידקים ב-2,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והחזירו את הכדור החיידקי ב-50 מיקרוליטר של מי מלח עם בופר פוספט (PBS) (pH 7.2-7.6) לכל עכבר שיידבק (למשל, עבור 10 מנות של 2 x 10⁶ חיידקים בכל מנה, הכדור של 2 x 10⁷ חיידקים יושבה מחדש ב-500 מיקרוליטר PBS). שוב, מומלץ להכין יותר חיסון ממה שנדרש. הכינו כמות שווה של PBS רק לחיסונים בקרה. שמור על האנוקלום המדבק ושליטה על PBS על הקרח עד להדבקה.
- לבצע שבעה דילול סדרתי של עשרה פעמים ל-PBS בפלטת דילול פלסטיק עם תחתית של 96 בארות, ולוחית של 25 מיקרוליטר מדוללים בכפילה על פלטות TSA רבעיות בתוספת קאנמיצין (30 מיקרוגרם/מ"ל) כדי למנות את כמות החיידקים האמיתית שהוזרקו. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה להקמת מושבה לפני הספירה.
2. זיהוי בעלי חיים
- סדר מספר מספיק של זוגות רבייה כך שהמלטות יוכלו להיות מסונכרן עבור גורים בגילאים תואמים. שונות גיל של ± יום אחד היא מקובלת.
- לזהות עכבר נקבה בהריון C57BL/6 ולנטר את לידת המלטה לפני הניסוי המתוכנן כדי לקבוע במדויק את הגיל.
- כדי להבחין בין גורים נגועים בני 3 או 4 ימים, השתמשו בזוג מספריים קטנים, עם קצה דק, כדי לגזור את קצות הזנבות של גורי הביקורת בלבד. הגורים הנגועים אינם מקבלים גזירות זנב. לפני החיתוך של הזנב, חטא את העור עם כדור כותנה שטוף ב-70% אתנול. לחץ על קצה הזנב עם כדור כותנה או גזה לפי הצורך.
הערה: הליך זה מתבצע תחת מכסה תא מטען בטיחות ביולוגית. גזירה בזנב של כ-1/8 אינץ' מספיקה. - כדי לזהות גורים בתוך קבוצת הביקורת והנגועים, השתמשו במזרק אינסולין בנפח 1 מ"ל עם מחט קבועה בגודל 28 גרם על חצי אינץ' לקעקוע זנבות הגורים. לפני הקעקוע, חטא את העור עם כדור כותנה שטוף ב-70% אתנול. הליך זה מתבצע תחת מכסה תא מטען בטיחות ביולוגית.
- כדי לקעקע את הזנב, מרחו דיו קעקוע של בעלי חיים על קצה המחט. לאחר מכן, החזק את הגור ביד אחת, כשהזנב חשוף לחלוטין. הכנס בעדינות את המחט מתחת לעור, תוך שמירה על עומק שטחי, והזיז את המחט במקביל לעור כמה מילימטרים עד שנוצר סימן קטן או נקודה קטנה. המתינו כמה שניות לפני שמוציאים לאט את המחט מתחת לעור, כדי למנוע שחרור עודף דיו מתחת לעור.
- לחץ על הפצע עם כדור כותנה או גזה לפי הצורך. הסירו את עודפי דיו הקעקועים על פני העור עם 70% אתנול.
- חזור על תהליך זה עם עכברים נוספים בקבוצות הנגועות וקבוצת הביקורת, תוך הוספת נקודה נוספת עם כל גור שמקועקע (למשל, לגור 1 יהיה נקודה אחת על הזנב, לגור 2 יהיו שתי נקודות בזנב, וכו').
הערה: לשכבת זיהוי נוספת, מומלץ להשתמש בצבעים נפרדים של דיו קעקוע בעלי חיים עבור קבוצות הביקורת והנגועים.
3. חיסון תת-סקפולי
הערה: למחקר זה, בוצעו שני ניסויים עם קבוצת מינון נמוך ומינון גבוה שהוקצתה לכל ניסוי. בניסוי הראשון, 7 גורים קיבלו חיסון במינון נמוך (4 גורים שימשו כביקורת), ו-5 גורים ממלטה נפרדת קיבלו את המינון הגבוה (3 גורים שימשו כגורי ביקורת). הגורים מהניסוי הראשון סיפקו נתונים רק לנקודת הזמן של 24 שעות. בניסוי השני, 8 גורים קיבלו חיסון במינון נמוך (2 גורים שימשו כביקורת), ו-6 גורים קיבלו חיסון במינון גבוה (2 גורים שימשו כביקורת). גורים מניסוי 2 סיפקו נתונים לנקודות הזמן של 0, 10 ו-24 שעות.
- התאמת גיל לגורים ≤ יום אחד. יש להקצות כל גור במינון נמוך או במינון גבוה. בתוך המלט, יש למנות גורים באקראי כגור ביקורת או כגור נגוע.
- ביום השלישי או הרביעי לאחר הלידה, רשמו את משקלי כל הגורים לפני החיסון ב-E. coli-lux או בבקרת PBS. הפרדו את הסכר מהגורים בתקופה זו כדי לוודא שהם לא יזזו במהלך ההדבקה.
- בתוך ארון בטיחות ביולוגית המשתמש במחט אינסולין, יש לשאוף או את PBS או את חיסון E. coli-lux . לעבודה זו השתמשו באינוקולות של 2 x 10⁶ ו-7 x 10⁶ לכל עכבר. שמרו על הקרח גם חיסון זיהומי וגם PBS עד למתן באמצעות הזרקה תת-סקפולרית.
- הנח את התינוק על משטח נקי בתוך מכסה הבטיחות של ארון הבטיחות הביולוגי והרם את העור בעורף הצוואר כאילו כדי ללטף את הגור.
- במרחב שנוצר כעת בין העור לשריר של בעל החיים, הכניסו את המחט, השפעו כלפי מעלה, ממש מתחת לעור, והזריקו 50 מיקרו-ליטר של PBS או E. coli-lux. במקביל שחררו את החלק הצבוט של העור כדי למנוע זרימה חזרה מהזריקה.
- הסר את המחט לאט ובזהירות. להחזיר את הגורים לסמים לאחר סיום ההזרקות. הערה: בשל שלב ההתפתחות האנטומי שלהם, מבחינה טכנית קשה לתת וריד זנב או זריקה תוך-פריטוניאלית לגורים יילודים ביום 3-4. לכן, למחקר זה נבחר מסלול הזיהום התת-סקפולרי בשל קלות הביצוע.
