זיהוי במקום של חיידקים בחתכי רקמת החניכיים של העכבר

תקציר

מקור: צ'וי, י. ס. ואחרים. זיהוי במקום של חיידקים בתוך רקמות מוטמעות בפרפין באמצעות גלאי DNA מסומן בדיגוקסין המיועד ל-16S rRNA. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים את זיהוי החיידקים בשטח בחתכי רקמת החניכיים של העכבר באמצעות גלאי DNA מסומנים בדיגוקסין המכוונים ל-DNA חיידקי. הקטע מודגר יחד עם הגשושית. מתווספים נוגדנים מצורפים אלקליין פוספטאז הספציפיים לדיגוקסין. פוספטאזים אנדוגניים מושבתים, ומשקע צבעוני מתקבל על ידי הוספת תת-קרקעית. החתך מוצבע נגד, מיובש, מנוקה בקסילן, ומותקן לפני הדמיה מיקרוסקופית של חיידקים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הבחינה האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. הכנת גשושית

1. הגברת PCR של הגשוש
   1. עבור הגשוש הספציפי Porphyromonas gingivalis, הגבירו קטע DNA בגודל 343 bp של P. gingivalis 16S rRNA באמצעות PCR באמצעות ה-DNA הגנומי של P. gingivalis והפריימרים הבאים: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3' ו-5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3'. בצע הגברות בתנאי המחזור הבאים: 35 מחזורים ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס למשך דקה ו-20 שניות, ואחריהם הארכה של 5 דקות ב-72 מעלות צלזיוס.
   2. הגביר את הגלאי האבבקטריאלי באמצעות קטע DNA באורך 70 bp (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTGTGTGAATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCCCCGCAACGAGCGCAACCC-3') שסונתז כאוליגונוקלאוטיד והפריימרים הבאים: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' ו-5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3'. בצע הגברות בתנאי המחזור הבאים: 40 מחזורים ב-94°C למשך 30 שניות, 60°C ל-30 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס למשך דקה ו-20 שניות, ואחריהם הארכה של 5 דקות ב-72 מעלות צלזיוס.
   3. השקיעו את תוצרי ה-PCR (≥500 מיקרוליטר) על ידי הוספת 3 M נתרן אצטט (pH 5.2) ו-100% אתנול (ביחס 10:1:2) ודגירה בטמפרטורה של -20°C למשך שעתיים.
   4. צנטריפוגה את התערובת בעוצמה של 14,000 x גרם למשך 15 דקות, החזירו את הכדור ל-100 מיקרוליטר של חומצה טריס-אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) או בופר TE, ומדדו את ריכוז ה-DNA לפי צפיפות אופטית ב-260 ננומטר.
2. תיוג דיגוקסיגנין (DIG) באמצעות ערכת תיוג וזיהוי DNA של DIG
   1. מערבבים 3 מיקרוגרם מהגשוש עם מים לנפח סופי של 15 מיקרוליטר.
   2. דנאטורציה של ה-DNA ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וקירור במהירות על הקרח.
   3. מוסיפים 2 מיקרוליטר של תערובת 10x הקסנוקלאוטידים, 2 מיקרוליטר של תערובת תיוג דאוקסינוקלאוזיד טריפוספט (dNTP), ו-1 מיקרוליטר של אנזים קלנוב ל-15 מיקרוליטר מה-DNA המנוטר.
   4. מערבבים ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות עד 48 שעות, ועצרו את התגובה על ידי חימום בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.
3. בדקו את רגישות הגשוש המסומן על ידי DIG באמצעות ערכת תיוג וזיהוי DNA של DIG
   1. טעין ידנית 1 מיקרו-ליטר של דילול סדרתי של גלאי הבקרה החיובי שסופק בערכה ו-1ng של גלאי מסומן DIG על ממברנת הניילון, וייבש אותו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   2. השרו לזמן קצר את הממברנה בבופר של 2 מלוחות-נתרן ציטראט (SSC) (0.3 M נתרן כלוריד או NaCl, 30 mM נתרן ציטראט, pH 7.0) ודגרו את הממברנה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לייצב את ה-DNA.
   3. השרו לזמן קצר את הממברנה בבופר חומצה מלאית (MAB, 0.1 M חומצה מאבית, 0.15 M NaCl, pH 7.5) ודגרו עם נוגדן אנטי-DIG אלקליני פוספטאז (AP) מדולל (1:5,000) ב-6 מ"ל של תמיסת חסימה שסופקה בערכה ב-RT למשך 30 דקות.
   4. שטפו את הממברנה עם MABT (MAB המכיל 1% Tween 20) ומרחו 40 מיקרוליטר של תמיסת ניטרו-כחול טטראזוליום/5-ברומו-4-כלורו-3'-אינדוליל פוספט (NBT/BCIP) מעורבבת עם בופר זיהוי של 2 מ״ל (0.1 M טריס(הידרוקסיתיל)אמינומתאן הידרוכלוריד או Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 0.05 M מגנזיום כלוריד או MgCl₂, pH 9.5) על הממברנה למשך דקה אחת. אם הרגישות של הגשוש המסומן אינה מספקת, חזור על השלבים מ-1.1.3 ל-1.3.4.
   5. מדדו את ריכוז ה-DNA של הגשוש המסומן (OD₂₆₀) והתאימו את הריכוז ל-100 ng μl-1.
4. בדוק את הספציפיות של הגשושית המסומנת על ידי DIG
   1. דגימות DNA גנומי דה-טבעי (25 ng3 מיקרוליטר-1 לדגימה) ממינים שונים של חיידקים, כולל החיידק המיועד על ידי הגלאי הספציפי, בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומתקררות במהירות על הקרח.
   2. טעין ידנית את ה-DNA המנותק על ממברנת הניילון וייבש אותו במשך 20 דקות ב-RT.
   3. להשרות לזמן קצר את הממברנה ב-2 בופר SSC ולדגור את הממברנה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי ליתק את ה-DNA.
   4. חסום את הממברנה עם תמיסת חסימה ב-RT למשך שעה.
   5. דילל את הגשוש במהירות של 1 ng μl-1 בבופר היברידיזציה, דנאטורציה של הגשושים המדוללים, ומרחם אותם על הממברנה.
   6. דגרו את הממברנה בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס למשך שעה.
   7. שטוף את הממברנה שלוש פעמים עם 2 בופר SSC.
   8. להשרות לזמן קצר את הממברנה ב-MAB.
   9. לדוג עם נוגדן אנטי-DIG מצומד AP מדולל (1:2,000) ב-6 מ"ל תמיסת חסימה ב-RT למשך שעה.
   10. שטוף את הממברנה עם MABT ומרח 40 מיקרוליטר של תמיסת NBT/BCIP מעורבבת עם בופר זיהוי של 2 מ"ל.
   11. כאשר הגשושית לא משיגת את הספציפיות הצפויה, יש להעלות את טמפרטורת ההיברידיזציה עד שנצפתה הספציפיות.

2. היברידיזציה במקום

הערה: כדי למנוע ייבוש של הדגימות והתגובות, יש לבצע את כל הדגרות בתא לחות מרופד במגבות נייר רטובות.

1. דה-פרפיניזציה והידרציה מחדש של חתכי רקמה
   1. הכינו 4 חתכי רקמה בעובי מיקרומטר מבלוקים מוטמעים בפרפין. פורמלין, פאראפורמלדהיד ומקבע מבוסס אבץ תואמים לפרוטוקול זה.
   2. הכינו את כל המגיבים באמצעות מים שטופלו בדיאתיל פירוקרבונט (DEPC).
   3. מחממים בתנור יבש בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ומדגירות ב-RT למשך 30 דקות.
   4. Immerse מחליק ב-100% קסילן למשך 5 דקות שלוש פעמים; השתמש בקסילן טרי בכל פעם.
      הערה: בצע את הליך הסרת השעווה הזה במכסה אדים כימי.
   5. טבלו ב-100% אתנול במשך 5 דקות פעמיים, תוך שימוש באתנול טרי בכל פעם, והחלישו דגימות בתמיסות אתנול סדרתיות של 90%, 80% ו-70% למשך 5 דקות כל אחת.
   6. טבלו שקופיות במים שטופלו ב-DEPC למשך דקה אחת ושטפו שקופיות במי מלח מופטפלים ב-DEPC או PBS (pH 7.4) למשך 6 דקות.
2. טיפולים מקדימים של חתכי רקמה
   1. טבלו סליידס בחומצה הידרוכלורית של 0.1 N למשך 20 דקות ושטיפו שקופיות במים שטופלו ב-DEPC למשך 30 שניות.
   2. צייר מחסום הידרופובי סביב דגימות באמצעות עט שעווה.
      הערה: גודל המחסום ההידרופובי תלוי בגודל הדגימות. לכן, נפחי המגיבים בשלבים הבאים משתנים בהתאם לגודל הדגימות, אך חייבים למלא את המחסום ההידרופובי (50 מיקרוליטר לדגימות קטנות ו-400 מיקרוליטר לדגימות גדולות).
   3. לטפל בדגימות ב-50 עד 400 מיקרוליטר של פרוטנאאז K (1 עד 10 מיקרוגרם ^מ"ל-1 ב-PBS מטופל ב-DEPC) בתנור יבש בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות ושטוף ב-1x PBS מטופל ב-DEPC למשך דקה אחת.
   4. השריה ב-4% פרפורמלדהיד ב-PBS מטופל ב-DEPC למשך 10 דקות, ואז שטוף את הסליידס ב-PBS מטופל ב-DEPC למשך דקה אחת.
   5. השרה של סליידס ב-0.1 מטר טריאתנולאמין-HCl (pH 8.0) המכיל 0.5% אנדריד אצטי למשך 20 דקות ומגלשי שטיפה במים מטופלים ב-DEPC למשך 30 שניות.
3. היברידיזציה עם הגשוש והשטיפה
   1. הטמעה ב-2 זיכרון SSC ל-20 דקות.
   2. דילל את הגלאי ב-1 ng ^μl-1 בבופר היברידיזציה (4x SSC, 50% פורמיד [vol/vol], 1x תמיסת דנהארט, 10% [משקל לנפח] דקסטרן סולפט, 0.1% [משקל לנפח] סודיום דודציל סולפט, 0.4 מ"ג DNA זרע סלמון). לבקרות שליליות, מערבבים את הגשוש המסומן עם כמות עודפת פי 10 של גלאי לא מסומן.
   3. דנאטורציה של הגששים המדוללים ומרח 50 עד 400 מיקרוליטר על חלקי רקמה. הניחו כיסוי על הסלייד ואטמו אותו עם לק.
   4. מחליק בחום במכשיר ה-PCR בטמפרטורה של 90°C למשך 10 דקות ומדגיר שקופיות בתא לח למשך הלילה (O/N) בטמפרטורה של 45°C או טמפרטורה אופטימלית שנקבעה בשלב 1.4.11.
   5. קיררו את הסליידס בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, הסרו את הכיסוי, וטבלו את הסליידס בבופר SSC סדרתי כדלקמן: 4 פעמים SSC ל-10 דקות, 2x SSC מחוממים מראש (45 °C) 2x SSC ל-20 דקות, 2x SSC ל-10 דקות, ו-0.2x SSC ל-10 דקות.
4. זיהוי באמצעות נוגדן קונוגטי AP אנטי-DIG
   1. שטוף שקופיות ב-MABT למשך 5 דקות.
   2. חסום עם 50 עד 400 מיקרוליטר של תמיסת חסימה עם 1% Tween 20 למשך 20 דקות.
   3. הוסיפו 50 עד 400 מיקרול של נוגדן אנטי-DIG-AP מדולל בתמיסת חסימה (1:1,000) ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
   4. לשטוף את המחסניות ב-MABT למשך 10 דקות.
   5. הטמינו שקופיות בזיכרון זיהוי שמכיל 1% טווין 20 למשך 5 דקות.
   6. לטפל ב-50 עד 400 מיקרוליטר של 1 מ"מ לבמיזול (בבופר זיהוי המכיל 1% Tween 20) למשך 5 דקות כדי להשבית פוספטאז אלקליני אנדוגני.
   7. פזר 50 עד 400 מיקרוליטר של תמיסת NBT/BCIP המעורבת מראש (מדוללת בבופר זיהוי ב-1:100) על כל דגימה ודחף את הסליידס בתא לח ב-RT למשך 2 עד 3 שעות עד שהאות המפותח יהיה מספק.
   8. שטוף את הסליידים במים דה-יוניים כדי לעצור את הוויזואליזציה ומרח 50 עד 400 מיקרוליטר של 0.05% מתיל ירוק כצבע נגד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   9. שטפו שקופים במים דה-יוניים, ייבשו ב-100% אתנול, וטבלו בקסילן.
   10. מרחו 80 מיקרוליטר של תמיסת התקנה על כל סלייד ומכסים עם מחסני כיסוי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אנידריד אצטי	סיגמא	6404
תמיסת סולפט דקסטרן 50%	מיליפור	S4030
הפתרון של 50X דנהארט	סיגמא	D2532
דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)	סיגמא	P159220
ערכת סימון וזיהוי DNA דיגוקסיגנין (DIG)	רוש	11 093 657 910
פורמיד	סיגמא	F9037
עט ImmEdge™	דאקו	H-400
לבאמיסול	וקטור	SP-5000
כלוריד מגנזיום	סיגמא	246964
חומצה מאלית	סיגמא	M0375
מתיל ירוק	סיגמא	M6776
פאראפורמלדהיד	סיגמא	P1648
פרמונט	פישר	SP15-500
תמיסת DNA זרע סלמון	Invitrogen	#15632-011
כלוריד נתרן	סיגמא	S9625
נתרן ציטראט	דוקסן	D1420
נתרן דודציל סולפט	אמרסקו	227
טריאתנולאמין-HCl	סיגמא	90279
טריס-HCl	מחקר אורגני	3098T