הדמיה בזמן אמת של זיהום חיידקי במודל עכבר באמצעות ביולומינסציה

תקציר

מקור: ולנטיין, מ. א. ואחרים, יצירת מוטנטים למחיקת גנים בתוך המסגרת ב-Pseudomonas aeruginosa ובדיקת החלשת אלימות במודל פשוט של זיהום בעכברים. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את השימוש בגישה של הדמיה מבוססת ביולומינסצנציה לניטור זיהום חיידקי במודל עכבר חי. הדמיה ביולומינצנטית רציפה וצילום רנטגן מאפשרת הדמיה בזמן אמת ומיקום אנטומי של הזיהומים המתפשטים ברחבי המארח.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים המוסדית המקומית וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

המחשה של הזיהום בביולומינציה

1. כדי להמחיש את התקדמות הזיהום, הכנס אופרון ביולומינצנטי כרומוזומי (luxCDABE) לזני Pseudomonas aeruginosa PGN5 ו-VE2 שנבדקו. הפלסמידים והפרוטוקול ששימשו לסימון זנים אלו פותחו במעבדת שוויצר וייתכן שאינם תואמים לכל המינים והזנים של החיידקים. חשוב לציין שהדמיית הזיהום היא אופציונלית; לכן, החדרה גנומית של אופרון זה אינה הכרחית לביצוע מחקר התמותה.
2. הכינו ואמת זנים. בנוסף, בדוק את הביולומינסנציה בזנים המסומנים בכל שלב אימות.
3. לאחר הכנת הזנים, מזריקים לבעלי החיים בקבוצות של 10 עם הזנים הביולומינצנטיים בהתאם לשלבים שלמעלה.
4. צילם את בעלי החיים כל 3 שעות במשך 24 שעות באמצעות מערכת הדמיה של בעלי חיים המסוגלת ללומיין ביולוגי.
   1. ראשית, הכן את המצלמה על ידי הגדרת פרמטרי המצלמה וחימום הבמה עבור בעלי החיים. לאחר מכן, כוון את זרימת החמצן ל-1.5 ליטר לדקה (או עקוב אחרי המלצות היצרן).
   2. לאחר שהמצלמה והשלב ייצבו, יש להכניס עכבר אחד לתא ההרדמה מיד לאחר ההזרקה ולהזריק איזופלורן של 3.5% לתא_{עם זרימת} חמצן למשך כ-4 דקות. שיטות ההרדמה עשויות להשתנות בהתאם לתא ו/או לחומר ההרדמה שבו משתמשים; עקבו אחר המלצות היצרן. קבע הרדמה נכונה באמצעות בדיקת רפלקס הגמילה.
   3. העבר את העכבר לשלב מייצב טמפרטורה. מקם את העכבר על גבו עם ידיים מושטות והתקן לו חרוט אף למתן איזופלורן של 2.5% במהלך תהליך ההדמיה.
   4. סגור את הדלת וצלם תמונות ביולומינסצנטיות וצילומי רנטגן של העכבר.
   5. כאשר ההדמיה מסתיימת, החזר את העכבר לכלוב שלו ועקוב אחריו. העכבר אמור להתעורר תוך 3-5 דקות.
   6. המשך לצלם עכברים כל 3 שעות במשך 24 שעות, בכל פעם עם עכבר שונה מכל קבוצה. אל תצלם מחדש עכבר תוך 24 שעות מחשש לתופעות לוואי מחשיפה חוזרת להרדמה. עכבר אחד צריך לקבל רק מנה אחת של הרדמה כל 24-36 שעות. נקה את פלטפורמת ההדמיה אחרי שכל עכבר צולם. כבה את המצלמה בין נקודות זמן ההדמיה.
      הערה: ביולומינסצנציה תדעך, ללא קשר לזן המוזרק. עוצמת ואורך החיים של ביולומינסצנציה משתנים בהתאם לגורמים רבים, כולל מספר החיידקים שהוזרקו, זן העכבר, זן החיידקים ועוד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אמבטיה יבשה דיגיטלית של בלוק אקקו	Labnet	NC0205808	דרך פישר סיינטיפיק
חממת ארונות	VWR	1540
איזותזיה איזופלורן	הנרי שיין בריאות בעלי חיים	29405
מערכת ההדמיה IVIS Lumina XRMS Series III In-Vivo	פרקינס ואלמר	CLS136340
אלקטרופורטור מיקרופולסר	BioRad	1652100
פריזמה 7	GraphPad		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ספקטרופוטומטר SmartSpec Plus	ביו-ראד	170-2525	או שיטה/ספק מועדף
מסנני מערכת הרדמה XAF-8	פרקינס ואלמר	118999
מערכת ההרדמה הגזית XGI 8	קליפר לייף סיינס/קסנוגן