$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים המוסדית המקומית וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
המחשה של הזיהום בביולומינציה
- כדי להמחיש את התקדמות הזיהום, הכנס אופרון ביולומינצנטי כרומוזומי (luxCDABE) לזני Pseudomonas aeruginosa PGN5 ו-VE2 שנבדקו. הפלסמידים והפרוטוקול ששימשו לסימון זנים אלו פותחו במעבדת שוויצר וייתכן שאינם תואמים לכל המינים והזנים של החיידקים. חשוב לציין שהדמיית הזיהום היא אופציונלית; לכן, החדרה גנומית של אופרון זה אינה הכרחית לביצוע מחקר התמותה.
- הכינו ואמת זנים. בנוסף, בדוק את הביולומינסנציה בזנים המסומנים בכל שלב אימות.
- לאחר הכנת הזנים, מזריקים לבעלי החיים בקבוצות של 10 עם הזנים הביולומינצנטיים בהתאם לשלבים שלמעלה.
- צילם את בעלי החיים כל 3 שעות במשך 24 שעות באמצעות מערכת הדמיה של בעלי חיים המסוגלת ללומיין ביולוגי.
- ראשית, הכן את המצלמה על ידי הגדרת פרמטרי המצלמה וחימום הבמה עבור בעלי החיים. לאחר מכן, כוון את זרימת החמצן ל-1.5 ליטר לדקה (או עקוב אחרי המלצות היצרן).
- לאחר שהמצלמה והשלב ייצבו, יש להכניס עכבר אחד לתא ההרדמה מיד לאחר ההזרקה ולהזריק איזופלורן של 3.5% לתאעם זרימת חמצן למשך כ-4 דקות. שיטות ההרדמה עשויות להשתנות בהתאם לתא ו/או לחומר ההרדמה שבו משתמשים; עקבו אחר המלצות היצרן. קבע הרדמה נכונה באמצעות בדיקת רפלקס הגמילה.
- העבר את העכבר לשלב מייצב טמפרטורה. מקם את העכבר על גבו עם ידיים מושטות והתקן לו חרוט אף למתן איזופלורן של 2.5% במהלך תהליך ההדמיה.
- סגור את הדלת וצלם תמונות ביולומינסצנטיות וצילומי רנטגן של העכבר.
- כאשר ההדמיה מסתיימת, החזר את העכבר לכלוב שלו ועקוב אחריו. העכבר אמור להתעורר תוך 3-5 דקות.
- המשך לצלם עכברים כל 3 שעות במשך 24 שעות, בכל פעם עם עכבר שונה מכל קבוצה. אל תצלם מחדש עכבר תוך 24 שעות מחשש לתופעות לוואי מחשיפה חוזרת להרדמה. עכבר אחד צריך לקבל רק מנה אחת של הרדמה כל 24-36 שעות. נקה את פלטפורמת ההדמיה אחרי שכל עכבר צולם. כבה את המצלמה בין נקודות זמן ההדמיה.
הערה: ביולומינסצנציה תדעך, ללא קשר לזן המוזרק. עוצמת ואורך החיים של ביולומינסצנציה משתנים בהתאם לגורמים רבים, כולל מספר החיידקים שהוזרקו, זן העכבר, זן החיידקים ועוד.