המחשה של זיהום בדרכי השתן במודל עכבר באמצעות ביולומינסצנציה

תקציר

מקור: Luyts, N., ואחרים. מעקב אורך של זיהומים בדרכי השתן וטיפול בהם בעכברים באמצעות הדמיית ביולומינצנציה. J. Vis. Exp. (2021).

הסרטון הזה מדגים את ההשראה והמעקב אחר זיהום בדרכי השתן במודל עכבר באמצעות E. coli ביולומינסנציוני שהוזרק לשלפוחית השתן, שם מתרחשים הידבקות, פלישה ושכפול תוך-תאי של חיידקים. האור הנפלט מהאופרון הביולומינצנטי משמש כסמן בזמן אמת לעומס חיידקים במהלך התקדמות הזיהום.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים המוסדית המקומית וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. חיסון בעלי החיים

1. הכנת בעלי החיים
   1. בחר את הזן הרצוי של העכברים בהתאם לשאלה המחקרית ולזמינות קווי הדחיפה, פרטי הניסוי והבדלים ברגישות לדלקות בדרכי השתן. חשוב לזכור שקטטריזציה דרך השופכה קלה יותר אצל עכברים נקבות. אין להשתמש בבעלי חיים מתחת לגיל 8 שבועות, שכן הם לא בוגרים מבחינה חיסונית. כאן השתמשו בעכברים נקבות בנות 12 שבועות מדגם C57Bl/6J.
   2. הזמינו את בעלי החיים מראש ותנו להם להסתגל, רצוי למשך 7 ימים. חיות קבוצתיות בכלובים מאווררים בנפרד, בתנאי אור/חושך סטנדרטיים של 12 שעות.
   3. גלח את אזור הבטן של בעלי החיים כדי להגביל את אובדן האות. אין להשתמש בקרם להסרת שיער, שכן הוא עלול לשרוף את עור בעלי החיים במהירות. לרסן את החיה על ידי אחיזה חזקה בעורף ובגפיים האחוריות ביד הלא-דומיננטית בזמן גילוח ביד הדומיננטית. חלופה נוספת היא להתגלח תחת הרדמה איזופלורנית.
      הערה: החיות גולחו יומיים לפני ההדמיה, בהתחשב בכך שהחיות יטפחו את האזור המגולח עוד יותר.
   4. לספק מים ואוכל סטנדרטי בחופשיות לאורך כל הניסוי. עם זאת, יש למנוע מבעלי חיים מים שעתיים לפני ההזרעה כדי למזער את נפח שלפוחית השתן במהלך ההזרעה.
   5. התקן קצה אנגיוקטטר סטרילי של 24 גרם על מזרק של 100 מיקרוליטר ומלא את המזרק בתמיסת החיידקים.
      הערה: כדי לקבוע את זוהר הרקע, יש לקבל תמונה בסיסית לפני ההטמעה (ראו שלב 2 בהמשך).
2. הטמעת בעלי החיים
   1. הניחו את בעלי החיים בתא השראה והרדימו אותם באמצעות שאיפת איזופלוראן עם חמצן טהור כגז נשא (השראה ב-3% ותחזוקה ב-1.5%).
   2. הניחו בעל חיים אחד על משטח עבודה במצב שכיבה ושמרו על הרדמה איזופלורנית יציבה באמצעות חרוט אף במהלך ההזרעה. מרחי את משחת העיניים.
   3. הוצא את שארית השתן על ידי לחיצה עדינה ותנועות מעגליות באזור העל-ערובית. נקה את הבטן התחתונה עם 70% אתנול לפני הזרעה.
   4. לשמן את קצה הקטטר במי מלח רגילים. הנח את האצבע המורה של היד הלא דומיננטית על הבטן ודחף אותה בעדינות כלפי מעלה. התחילו את הקטטריזציה של השופכה בזווית של 90° (אנכית) וכאשר נתקלים בהתנגדות, הטינו אותה אופקית לפני הכנסתה נוספת (0.5 ס"מ).
      הערה: לעולם אל תלחץ בכוח על הקטטר, כי זה עלול לגרום נזק לשופכה. תנועות סיבוב עדינות יכולות לסייע בהכנסת קטטר. מצד שני, חוסר התנגדות בדרך כלל מעיד על הכנסה שגויה.
   5. בצע החדרה איטית (5 מיקרוליטר לשנייה) של 50 מיקרוליטר של החיידקי (2 x 10⁷ CFU).
      הערה: נפחים גבוהים יותר או הזרעה מהירה יותר עלולים לגרום לרפלוקס לכליות. במהלך תרגול הטכניקה, ניתן להשתמש בדיו כחול להערכת רפלוקס.
   6. לאחר ההזרעה, השאירו את המזרק והקטטר במקום עוד כמה שניות ואז נסוגו לאט כדי למנוע דליפה. רשמו כל אי-סדירות כמו כמות גבוהה של דליפה או דם בדם והחריגו בעלי חיים, במידת הצורך.
   7. מקם את החיה בשכיבה בשכיבה בקונוס האף של תא ההדמיה וחזר על השלבים הקודמים 1.1.1-1.1.6 עבור כל בעלי החיים הנותרים. השתמש בקטטר אחד לכל קבוצת ניסוי. ודאו שההרדמה מתקיימת וממזערים את הזמן בין החיה הראשונה לאחרונה.
   8. במידת הצורך, ניתן אנטיביוטיקה או תרופות ניסיוניות לפני או אחרי ההדמיה (שלב 2). לדוגמה, כדי להזריק אנרופלוקסצין, הוסף 40 מיקרו-ליטר מהתמיסה של אנרופלוקסצין (100 מ"ג/מ"ל) ל-3.96 מ"ל של מלח פיזיולוגי כדי לקבל דילול של 1/100. הזרקו 100 מיקרוליטר/10 גרם תת-עורית בשעה 9:00 בבוקר ובשעה 17:00 כדי להזריק 10 מ"ג/ק"ג אנרופלוקסצין פעמיים ביום במשך 3 ימים.

2. הדמיית ביולומינסצנטה

1. הכנה ובחירת פרמטרי הדמיה
   1. פתח את תוכנת רכישת BLI (ראה טבלת חומרים) ולחץ על אתחול במכשיר ההדמיה (ראה טבלת חומרים) כדי לבדוק את מערכת המצלמה ובקר הבמה ולקרר את מצלמת ה-CCD ל-90 מעלות צלזיוס.
      הערה: במהלך תהליך זה, הדלת ננעלת, וניתן לעקוב אחרי התקדמות האתחול בלוח הבקרה. אור ירוק מציין שהטמפרטורה של מינוס 90°C הושגו. תופיע אזהרה אם ינסו לבצע הדמיה לפני השלמת האתחול.
   2. ודא שהנתונים נשמרים אוטומטית: לחץ על 'שמירה אוטומטית' ובחר את התיקייה הנכונה.
   3. בחר זוהר וצילום. בדוק את הגדרות הזוהר ברירת המחדל: הגדר את מסנן העירור ל-Block ואת מסנן הפליטה ל-Open.
   4. הגדר את זמן החשיפה לאוטומטי בעת צילום התמונה הראשונה, במיוחד כשמצפים לאות עמום, כדי להבטיח מספר מספק של ספירת פוטונים. למדידות in vivo ואותות בהירים, הגדר את זמן החשיפה ל-~30 שניות. אם התמונה רוויה, תופיע אזהרה. אם זה קורה, הקטן את זמן החשיפה.
   5. בחר את ה-Binning הבינוני, F/עצירה 1, ובחר את שדה הראייה הנכון (שדה ראייה) (D עבור 5 בעלי חיים).
   6. הגדר את גובה הנבדק ל-1 ס"מ בעת הדמיה של עכברים.
   7. לחצו על Add שלוש פעמים בלוח הבקרה של הרכישה כדי לקבל רצף של שלוש תמונות, כאשר הטכניקה משוחזרת.
2. הדמיה
   1. הניחו את העכברים בתא ההדמיה במצב שכיבה והשתמשו בקונוס האף של המניפולד לשמירה על הרדמה (איזופלוראן 1.5%) לאורך כל הניסוי. צילם עד 5 עכברים בו זמנית והפריד בין בעלי החיים באמצעות מחסום האור כדי למנוע השתקפות.
   2. סגור את הדלת ולחץ על Acquire כדי להתחיל את רצף הדמיה.
   3. מלאו מידע מפורט על הניסוי (חיות מסוג בר וחיות מכריעות, טיפולים, יום הדמיה וכו'). הגדרות ההדמיה, כמו זמן החשיפה, נשמרות אוטומטית.
   4. הוציאו עכברים מתא ההדמיה והחזירו אותם לכלוב שלהם. בדוק את ההחלמה המלאה אחרי ההרדמה. בתוך דקות, החיות אמורות להיות ערות לחלוטין וחוקרות. אל תן הקלה לכאבים כי זה עלול להפריע לתהליך זיהום בדרכי השתן.
   5. החזירו את הכלובים למדפים המאווררים עד למחזור ההדמיה הבא. לאחר סיום הניסוי, יש להמתים את בעלי החיים באמצעות חנק_CO2 או ניתוק צוואר הרחם. עשה זאת לפני ההחלמה מההרדמה איזופלורנית כדי למזער את המצוקה

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מאדה הרדמה	הרווארד אפרטוס לימיטד	לא זמין	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
בייטריל 100 מ"ג/מ"ל	באייר	לא זמין	אנרופלוקסצין
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	אנגיוקטטר צהוב, השתמש בקצה פלסטיק סטרילי להטמעה
עכברים C57Bl/6J	ג'אנבייה	לא זמין
צנטריפוגה 5804R	אפנדורף	EP022628146
דרופסנס 16	Unchained Labs	טריניאן	למדידת OD 600 ננומטר
הפוספט של דולבקו מגן מלח, Gibco	תרמופישר סיינטיפיק	הפניה 14040-083
5 ליטר מנוטר 70% אתנול	VWR בינלאומית	85825360
צינור פוליסטירן עגול 14 מ״ל של פלקון, קפ-קפ	קורנינג	352057
פאלקון 50 מ"ל סלסטארט	גריינר	227285
מזרק Hamilton GASTIGHT, מנעול לואר PTFE, 100 מיקרוליטר	סיגמא-אלדריץ'	26203	כדי להבטיח הזרמת חיידקים איטית של 50 מיקרו ליטר
לולאת חיסון	רות'	6174.1	מחזיק: Art. מס' 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	מוצרי וטרינריה של דקרה	לא זמין	איזופלוראן
מערכת הדמיה IVIS In Vivo	פרקיןאלמר	124262 מקור	מכשיר הדמיה