הכנת תרבית אגרובקטריום להעברת גנים לתאי הצמח

תקציר

מקור: שי, ג', ואח', סקר וזיהוי מדכאי השתקת RNA מאפקטורים מופרשים של פתוגנים צמחיים. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את ההליך להכנת תרבית Agrobacterium tumefaciens על ידי השראת ביטוי גנים של אלימות באמצעות אצטוסירינגון, ולאחר מכן הסרת אנטיביוטיקה באמצעות שטיפה והשעיה מחדש, ליצירת השעיה מוכנה לשינוי להעברת גנים לרקמות הצמח.

פרוטוקול

1. הכנת תרבית אגרובקטריום לחדירה

1. בחר מושבה חיובית מלוח Luria-Bertani (LB) והחריך את התאים בצינור זכוכית המכיל 5 מ"ל מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם/מ"ל קאנמיצין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל ריפאמפיצין. גדלו את התאים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד למשך 24−48 שעות.
2. העבר 100 מיקרולטר תרבית ל-5 מ"ל של מדיום LB בתוספת אותה אנטיביוטיקה, 10 מ"מ חומצה אתאנסולפונית 2-(N-מורפולינו) (MES; pH 5.6), ו-20 מיקרומום אצטוסירינגון (AS). גידול חיידקים ב-30 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד למשך 16−20 שעות.
3. תאי צנטריפוגה בעוצמה של 4,000 x g למשך 10 דקות. שפוך את הסופרנטנט ותשהה מחדש את הכדור ב-2 מ"ל של בופר 10 מ"מ MgCl₂ .
4. חזור על שלב 1.3 כדי להבטיח הסרה מלאה של האנטיביוטיקה.
5. קבעו את צפיפות תרבית האגרובקטריה על ידי מדידת צפיפות אופטית ב-600 ננומטר (OD₆₀₀). כוון ל-OD₆₀₀ של 1.5−2.0 עם בופר MgCl₂ של 10 mM.
6. הוסיפו 10 mM MES (pH 5.6) ו-150 מיקרומום AS לתרביות ההשעיה הסופיות ודגרו את התאים ב-RT לפחות 3 שעות ללא רעידה.
   הערה: אל תשאיר את תרביות ההשעיה הסופיות בין לילה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-מורפולינואתןסולפוניק חומצה (MES)	Biofroxx	1086GR500	בופר
אצטוסירינגון (AS)	סיגמא-אלדריץ'	D134406-5G	השראה של אגרובקטריה
אגר	סיגמא-אלדריץ'	A1296-1KG	LB בינוני
בקטו טריפטון	BD ביוסיינסס	211705	LB בינוני
הפקת שמרי בקטו	BD ביוסיינסס	212750	LB בינוני
סולפט קאנמיצין	סיגמא-אלדריץ'	K1914	אנטיביוטיקה
ריפמפיצין	ביומדיקל MP	219549005	אנטיביוטיקה
כלוריד נתרן	אמרסקו	0241-10 ק"ג	LB בינוני