הכנת רקמת שלפוחית השתן של העכבר להמחשת זיהום חיידקי

תקציר

מקור: O'Brien, V. P., ואחרים, זיהום שובב בדרכי השתן של Escherichia coli שנגרם מחשיפת שלפוחית השתן בגרדנרלה בנרתיק בעכברים. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ אלקטרוני סורק כדי להמחיש קולוניזציה חיידקית ואינטראקציות בין מאכסן-פתוגן באפיתל השלפוחית של מודל עכבר שנדבק מראש.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים המוסדית המקומית וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הדמיית שלפוחית באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת

   הערה: הליך זה יכול להתבצע בכל נקודת זמן שבה רצוי לראות את האורותליום. כפי שמצוין באיור 1 (קופסאות סגולות), אינטראקציות אורופתוגניות בין E. coli (UPEC) לאורותליאליות מוצגות בצורה הטובה ביותר בין 6 שעות ל-24 שעות לאחר חיסון UPEC בשלב יצירת המאגר, ופילוף האורותליאלי המופעל על ידי Gardnerella vaginalis נראה בצורה הטובה ביותר בין 3 שעות ל-12 שעות לאחר החשיפה השנייה ל-G. vaginalis .

   1. קיבוע שלפוחית השתן במקום
      1. הכינו קיבוע מיד לפני קציר שלפוחית השתן על ידי הוספת גלוטראלדהיד (2.5% סופי) ופארפורמלדהיד (2% סופי) בבופר קקודילט נתרן של 0.15 מ' עם 2 מ"מ מולר CaCl₂ ב-pH 7.4. השתמש בפרפורמלדהיד וגלוטראלדהיד מאפולות זכוכית שנפתחו זה עתה, שכן שני המקבעים מתחמצנים עם הזמן במכלים פתוחים. אזהרה: גלוטארלדהיד רעיל, מגרה נשימתי וקורוזיבי; פאראפורמלדהיד הוא דליק, מסרטן, מגרה ורעלן רבייתי; קקודילאט נתרן הוא רעיל ומסרטן.
      2. כדי לייצר 50 מ"ל תמיסה קיבועה, הוסף 6.25 מ"ל של 16% פאראפורמלדהיד, 2 מ"ל של 50% גלוטראלדהיד ו-16.75 מ"ל מים אולטרה-טהורים ל-25 מ"ל של תמיסה של 0.3 מ' נתרן קקודילאט ב-pH 7.4 עם 4 מ"מ מ' CaCl₂.
      3. חממו את הקיבוע המוכן ל-37 מעלות צלזיוס לפני מתן השלפוחית.
      4. מלאו את מזרק קצה הטוברקולין במקבע והדביקו קטטר לקצה, כשהמזרק הפונה לסימוני המזרק הנגדיים. גזום את הצינור העודף 1-2 מ"מ מקצה המחט, תוך זהירות לא לחשוף את קצה המחט. הפעילו את המזרק כדי להסיר בועות ודחפו את הבוכנה לאוויר ריק, ומלאו את הקטטר בחומר קיבוע מעל צינור מיקרוצנטריפוגה כדי לאסוף כל קיבע לצורך הטמנה נכונה.
      5. הרדמו והקריבו את העכבר בשיטה מאושרת (למשל, פריקה צווארית תחת הרדמה). הנח את העכבר על משטח הניתוח כשהרגליים מאובטחות (עם גומיות או סיכות). פתח את אזור האגן של העכבר עם מלקחיים וזוג מספריים כירורגיים כדי לחשוף את שלפוחית השתן. דחפו בזהירות את השומן הסמוך אך השאירו את השלפוחית במקום.
      6. החזק את המזרק עם היד הדומיננטית כשהמחט פונה כלפי מטה וסימני המחט והסימנים של המזרק פונים הרחק ממך. טבלו את קצה הקטטר בחומר סיכה סטרילי.
      7. מקם את קצה הקטטר בפתח השופכה, מחזיק את קנה המזרק הרחק בזווית של 30-45° מעל גוף העכבר.
      8. הפעילו לחץ כלפי מטה בתנועה קטנה מאוד עם כיוון השעון עם הקצה והכניסו בעדינות את הקטטר לשופכה. כאשר קצה הקטטר נכנס לשופכה, הפכו את המזרק לכיוון זנב העכבר תוך המשך החלקת הקטטר עמוק יותר לתוך השופכה עד שקנה המזרק יהיה מקביל למשטח העבודה. כל ציר המחט של הקטטר (למעט הבסיס) אמור להיכנס לעכבר, ולמקם את קצה הקטטר בתוך לומן שלפוחית השתן.
      9. העבירו לאט 50-80 מיקרוליטר של קיבוע, מה שגורם לשלפוחית התנפח כמו בלון. השאר את הקטטר במקום והרים מעט את המזרק, תוך הטיית הקצה כלפי מעלה.
      10. ביד השנייה, פתחו המוסטאט והחליקו שיניים מתחת למחט הקטטר בצומת השופכה. סגור חלקית את ההמוסטט עד שהוא פשוט נוגע במחט.
      11. החלק בעדינות את מחט הקטטר החוצה משלפוחית השתן תוך כדי הידוק ונעילת ההמוסטט לחלוטין כדי למנוע אובדן הקיבוע.
      12. אחוז את ההמוסטט כך שיהיה מקביל למשטח העבודה כשהשלפוחית מונחת עליו. הרימו בעדינות וחתכו בזהירות מתחת להמיסטט (הצד הנגדי של שלפוחית השתן) כדי להסיר את השלפוחית כשההמוסטט עדיין מחובר.
      13. הכניסו את שלפוחית השתן וההמוסטט לתוך צינור פלקון המכיל קיבוע מחומם. ודאו שהשלפוחית שקועה לחלוטין בנוזל ולא לחוצה אל דפנות הצינור. דגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
   2. עיבוד והדמיה של שלפוחית השתן באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)
      1. חצו את שלפוחית השתן בקשת עם להב גילוח נקי ודו-צדדי, וצרו חתך שני ברוחב הסמוי להמוסטאט כדי לשחרר את השלפוחית. זה מוביל לשני "כוסות" חצי שלפוחית. אם נשארו כריות שומן בחלק החיצוני של שלפוחית השתן, הסירו אותן בעדינות.
      2. שטוף את חצאי השלפוחית שלוש פעמים (10 דקות כל אחת) בבופר קקודילאט נתרן (0.15 מ', pH 7.4).
      3. צבעו את הרקמה בטטרוקסיד אוסמיום של 1% בבופר קקודילט של 0.15 מטר למשך שעה בטמפרטורת החדר. אוסמיום רגיש לאור; לכן, בצע את השלב הזה עם כלי הצביעה עטוף בנייר כסף כדי לשמור על סביבה חשוכה. ​
         אזהרה: אוסמיום טטרוקסיד הוא רעיל ומכאיל לעור. תעשה את הצעד הזה במכסה האדים עם כפפות.
      4. שטוף את חצאי השלפוחית שלוש פעמים (10 דקות כל אחת) במים אולטרה-טהורים. במהלך שלבים אלו, לעיתים ניתן לראות שמן אוסמי על פני המים. שאף או פתח את זה כדי למנוע זיהום בשלבי הייבוש.
      5. ייבוש רקמות על ידי טבילה בסדרת אתנול מדורגת (50, 70, 90, 100 ו-100%) למשך 10 דקות כל אחת.
      6. ייבשו את הרקמה הקבועה באמצעות מייבש נקודה קריטית, תוך ביצוע 12 החלפות_CO2 במהירות האיטית ביותר. הגדר את כל ההגדרות הנוספות להאטה, חוץ משלב האוורור, שמוגדר למהיר.
      7. חצו שוב כל חצי שלפוחית עם סכין גילוח נקייה דו-צדדית כדי ליצור 4 חלקים בסך הכל, להפחתת עקמומיות הדגימה, לציפוי יעיל יותר, להקל על הדמיה ב-SEM, ולחשיפה רקמה שעלולה להתעקל במהלך הייבוש.
      8. הדביקו את חלקי השלפוחית ללשונית דבק פחמן מוליך על קצה אלומיניום וצבעו כמות קטנה של דבק כסף סביב המגע התחתון עם קיסם, תוך זהירות למנוע מדבק עודף לספוג על פני השטח הפנימיים של השלפוחית.
      9. השתמש בציפוי ספטר עם וואקום גבוה כדי לצפות את שבבי הדגימה ב-6 ננומטר אירידיום. אם הדגימות ממשיכות להיטען, יש לוודא שמסלול מוליך צבוע על פני השטח בצבע כסף וצפוי בתוספת של 4 ננומטר של אירידיום.
      10. תדמיין את הדגימות במיקרוסקופ אלקטרוני סורק. למרות שהתנאים עשויים להשתנות בהתאם למיקרוסקופ בו משתמשים, מתח מואץ של 3 KeV עם זרם קרן של 200 pA ומרחק עבודה של 12-13 מ"מ עבד היטב על Zeiss Merlin FE-SEM בעת שימוש בגלאי אלקטרונים Everhart-Thornley (SE2).

תוצאות

איור 1. סכמטי של מודל העכבר. ציר הזמן מודגש כך שישקף את השלבים או הנהלים של המודל המפורטים בפרוטוקול. שלב 1 (כתום): הקמת מאגרי E. coli אורופתוגנים תוך-תאי (UPEC). העכברים מחוסנים דרך השופכה ב-UPEC, ודגימות שתן נאספות ומפוקחות לניקוי ב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מחטים בגודל 30G x 1/2	BD	305106	לקטטרים
המוסטט מלקחי ישר בגודל 5 1/2"	מקסון	487377	קיבוע שלפוחית השתן במקום
מצפוי הספטר ACE 600	לייקה		עיבוד דגימות SEM
קטע SEM מאלומיניום	טד פלה	16111	עיבוד דגימות SEM
כלוריד סידן	EMS	12340	קיבוע שלפוחית השתן במקום
לשונית דבק פחמן מוליך	טד פלה	16084-1	עיבוד דגימות SEM
צבע כסף מוליך	טד פלה	16034	עיבוד דגימות SEM
מייבש נקודת קריטית CPD 300	לייקה		עיבוד דגימות SEM
קליפס מתכת של ציטופוננל	Simport	M964B	ניתוח שתן בסיטוספין
אתנול	EMS	15050	עיבוד דגימות SEM
גלוקוז	סיגמא	G7528	עבור מדיית גדילה של NYCIII G. vaginalis
גלוטראלדהיד	EMS	16320	קיבוע שלפוחית השתן במקום
ערכת צביעת Hema 3	פישר	23123869	בדיקת שתן בסיטוספין
HEPES	סלגרו	25-060-Cl	עבור מדיית גדילה של NYCIII G. vaginalis
אירידיום	טד פלה	91120	עיבוד דגימות SEM
מרלין FE-SEM	צייס		מיקרוסקופ אלקטרוני סורק
מטהר מים Milli-Q	מיליפור	IQ-7000	עיבוד דגימות SEM
טטרוקסיד אוסמיום	EMS	19170	עיבוד דגימות SEM
פאראפורמלדהיד	EMS	15710	קיבוע שלפוחית השתן במקום
צינורות פוליאתילן	אינטרמדיק	427401	לקטטרים
פרוטאוז פפטון #3	פישר	DF-122-17-4	עבור מדיית גדילה של NYCIII G. vaginalis
להב גילוח כפול מצופה PTFE	EMS	72000	חיתוך שלפוחית ל-SEM