בידוד וגידול חיידקים מעוברי דגי זברה להערכת עומס זיהום

תקציר

מקור: ברנוט, א., ואח', פענוח והדמיה של פתוגנזה ודימות של מיקובקטריום אבססיסוס בעוברי דגי זברה. J. Vis. Exp. (2015).

הסרטון הזה מדגים פרוטוקול לבידוד וכימות של Mycobacterium abscessus מעובר דג זברה נגוע. ההליך כולל המתת חסד של עוברים, ניתוק רקמות והומוגניזציה לשחרור החיידקים, ולאחר מכן צנטריפוגה והשעיה מחדש בבופר סורפקטנטים. לבסוף, ההשעיה החיידקית מדוללת באופן סדרתי, מצופה על אגר עם תוספת אנטיביוטיקה, ומודגרת כדי לאפשר יצירת מושבות וכמות.

פרוטוקול

1. הכנה ואחסון של חוסון M. abscessus
   1. תנאי גדילה של M. abscessus
      1. הוציאו את M. abscessus ממאגר גליצרול -80°C אל אגר מידלברוק 7H10 המכיל 10% OADC ו-0.5% גליצרול (7H10OADc) והוספו לאנטיביוטיקה המתאימה בהתאם לסמן העמידות הנושא הווקטור המקודד את החלבון הפלואורסצנטי. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 4-5 ימים.
      2. קחו מושבה מיקרובקטריאלית חיובית בפלואורסצנציה והחסנו 1 מ"ל מרק מידלברוק 7H9 בתוספת OADC, 0.2% גליצרול, 0.05% טווין 80 (7H9OADc/T) עם האנטיביוטיקה הנדרשת בצינור פלסטיק סטרילי של 15 מ"ל. דגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שבוע ללא רעידות.
         הערה: טווין 80 מגביל הצטברות והתרכסות חיידקים.
      3. החזירו את הטרום-תרבית שהתקבלה ב-2.1.2 ב-50 מ"ל Middlebrook 7H9OADc/T בבקבוקי תרביות רקמה בנפח 150 ס"מ רבוע עד ל-0.1 OD₆₀₀ סופיים (המקביל לכ-5.107 חיידקים/מ"ל) והמשיכו לדגר ב-30°C למשך 4 ימים לקבלת תרבית שגדלה באופן מעריכי (OD₆₀₀ = 0.6 עד 0.8).
         הערה: כדי למזער הצטברות, במיוחד בגרסה המחוספסת, הדגירה לא צריכה לעלות על 5 ימים. גם גרסאות חלקות וגם גסות מציגות קצב גידול דומה.
2. הכנת ה-M. abscessus inocula
   הערה: עקב הנטייה הגבוהה של M. abscessus גס ליצור אגרגטים גדולים ולייצר חוטים, יש צורך בטיפול ייעודי ליצירת אינקולה הומוגנית ומבוקרת כמותית לפני הזרקות מיקרו בעוברים. טיפול זה מיושם גם על חיידקים חלקים שמייצרים אגרגטים, אם כי במידה פחותה יותר מהזן המחוספס.
   1. קצור תרביות שגדלות באופן אקספוננציאלי מבקבוקי תרביות רקמה בגודל 150 ס"מ רבוע באמצעות צנטריפוגה בעוצמה של 4,000 x גרם למשך 15 דקות ב-RT בצינור פלסטיק סטרילי של 50 מ"ל, והשיה מחדש את הכדור החיידקי ב-1 מ"ל 7H9OADc/T. Aliquot של 200 מיקרו ליטר של תללים חיידקיים לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
      הערה: עבודה עם נפחים קטנים במזרקים בנפח 1 מ"ל היא הכרחית להשגת תליות הומוגניות מאוד.
   2. הומוגניזציה של השעיות החיידקים עם מחט 26-G (15 רצפים למעלה ולמטה), סוניקציה שלוש פעמים במשך 10 שניות (עם הפסקות של 10 שניות בין כל רצף סוניקציה) באמצעות סוניקטור אמבט מים. הוסף 1 מ"ל של 7H9OADc/T ומערבולת לזמן קצר. צנטריפוגה 3 דקות ב-100 x g.
   3. אספו בזהירות את הסופרנטנטים המכילים מיקובקטריה כדי להימנע מהגושים ולרכז את התלשות ההומוגניות בצינור פלסטיק סטרילי בנפח 50 מ"ל.
   4. בדוק ויזואלית את נוכחות האגרגטים החיידקיים שנותרו בסופו של דבר.
      הערה: אם האגרגטים עדיין קיימים, יש לבצע שלב צנטריפוגציה נוסף בעוצמה של 100 x g למשך 2 דקות, ולאסוף את הסופרנטנט.
   5. צנטריפוגה את המתלה בעוצמה של 4,000 x g למשך 5 דקות, החזירו את הכדור ל-200 מיקרוליטר 7H9OADc/T וממשיכים להזרקה.
   6. הערכת ריכוז החיידקים הסופי על ידי ציפוי דילול סדרתי (ב-1x PBST) על אגר 7H10OADc וספירת יחידות יוצרות מושבות (CFU) לאחר 4 ימי דגירה ב-30 מעלות צלזיוס. יש לקבוע CFU עבור כל אצווה חדשה.
   7. הכינו מלאי אינוקולה קפואים על ידי אחסון 5 מיקרול אליקוות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: הערכת ה-CFU של האליקובטים הקפואים בטמפרטורה של מינוס 80°C היא תנאי מוקדם לקביעת מספר החיידקים המדויק הבריאים, שכן הקפאה או הפשרה עלולים להשפיע על חיוניות החיידקים של החידוק. האינוקולות הקפואות מוכנות לשימוש בהזרקות הבאות. מכיוון שכל האליקוטים מכילים את אותו מספר של CFU, הם מאפשרים הזרקת חיידקים בצורה שניתנת לשחזור מניסוי לניסוי.
3. בקרת איכות אינוקולום
   הערה: צביעת Ziehl-Neelsen (ייחודית למיקובקטריה) יכולה לשמש להשוואת איכות ההשענות החיידקיים לפני ואחרי הליכי ההומוגניזציה.
   1. לאתר ולפרס טיפה אחת של ההומוגני החיידקי על מגלש זכוכית ולתת לה להתייבש לחלוטין. תקן את הממרח לפחות 30 דקות על פלטה חמה שמכוונת ל-65-70 מעלות צלזיוס וצביע באמצעות פרוטוקול צביעה של Ziehl-Neelsen.
   2. התבונן בממרח החיידקים במיקרוסקופ באמצעות אובייקטיב 100X והשווה לממרח של תלייה חיידקית לא מעובדת (איור 1).

2. הכנת עוברים של דגי זברה

1. הטלה ואיסוף ביצי דגי זברה
   1. ביום שלפני ההטלה, יש להרבות דגי זברה בוגרים על ידי הצבת 2 זכרים ונקבה אחת (בדרך כלל יחס 2:1 מאפשר קצב הפריה מיטבי) בתא רבייה, הכולל אקווריום נפרד עם סלסלת איסוף ביצים.
      הערה: סלי איסוף ביצים משמשים להגנה על הביצים מאכילת ההורים ולהקל על קצירת הביצים.
   2. בעוצמה של 1 כ"פ (כוח), קצור ביצים ורק עוברים שהתפתחו כראוי בצלחת פטרי 100 מ"מ מלאה ב-25 מ"ל מים של דגים כחולים (מקסימום 100 עוברים בכל צלחת) ושומרים אותם בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. ביציות לא מופריות מושלכות.
2. הכנת עוברי דג זברה להזרקות
   1. בכ-24 שעות לאחר ההפריה (HPF), דכוריון את העוברים עם פינצטה עדינה בצלחת פטרי של 100 מ"מ ושמרו על טמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס.
   2. אספו את העוברים של 30-48 כוחות סוס באמצעות פיפטה והעבירו אותם לתא מיקום בצורת "V" המלא ב-25 מ"ל מי דגים המכילים 270 מ"ג/ל טריקאין. הנח את העוברים כראוי בתעלות באמצעות כלי קצה מיקרולודר ביתי (קצה מיקרולודר מחותך בבית) מותאם למניפולציה מיקרו-קלה יותר.
      הערה: כיוון את הצד הגבי כלפי מטה להזרקות תוך ורידיות בווריד הזנב או את הצד הגבי כלפי מעלה להזרקות שרירי הזנב.

3. הליך מיקרו-הזרקה

הערה:. כדי להעריך את הכרונולוגיה של זיהום ב-M. abscessus (הישרדות, עומסי חיידקים, קינטיקה ומאפייני ההדבקה), מועדפים הזרקות לווריד הזנב של עוברים של 30 hpf. כדי להמחיש את גיוס תאי החיסון, ההזרקות מתבצעות באתרים מקומיים, כמו בשרירי הזנב של עובר עם 48 hpf.

1. מדלל את החיסון המיובקטריאלי ב-1X PBST (תלוי במספר ה-CFU שיינתן), המכיל 10% פנול אדום כדי לבדוק את ההזרקה הנכונה.
2. טעין מחט הזרקה מיקרוקפילרית ב-5-10 מיקרוליטר של החיסון באמצעות קצה מיקרולודר, חבר את מחט המיקרו-הזרקה למחזיק המיקרומניפולטור התלת-ממדי המחובר למזרק, ושבר את ראש המחט עם פינצטה עדינה לקבלת קוטר פתיחה של 5-10 מיקרון.
3. כיול נפח ההזרקה על ידי התאמת לחץ המיקרו-הזרקה (20-50 hPa) והזמן (0.2 שניות).
   הערה: נפח ההזרקה הנדרש מכויל על ידי קביעה חזותית של קוטר הטיפה שנפלטת לחלמון העובר.
4. להזרקת וריד הזנב, מקם את העובר כשהצד הגחוני פונה למחט והניח את קצה המחט קרוב לפתח האורוגניטלי, מכוון לווריד הזנב, ודחוף בעדינות את קצה המחט לתוך העובר עד שהיא חודרת רק לאזור הווריד הזנבתי. לספק את נפח ההכנה החיידקית הרצוי, בדרך כלל 1-3 ננוליטר, המכיל כ-100 CFU/nl.
5. להזרקה תוך-שרירית, יש למקם את העובר כך שהצד הגבי פונה למחט, הנח את המחט מעל סומיט אחד, והזריק נפח קטן (1 נ"ליטר) של אינוקולום.
   הערה: לגבי הזרקות לווריד הזנב, גם הזרקות תוך-שריריות הן מאתגרות לביצוע. יש להיזהר להימנע מעומס יתר, שעלול לפגוע ברקמות הסובבות.
6. בסיום הליך ההזרקה, יש לשלוט בגודל החיסון על ידי הזרקת אותו נפח של תלייה חיידקית בטיפה של PBST סטרילי, ולאחר מכן ציפוי על 7H10OADc וספירת ה-CFU. כ-100 עוברים יכולים להיות מוזרקים במחט.
   הערה: מכיוון ש-M. abscessus המחוספס עשוי להמשיך ליצור אגרגטים במחט, יש לבצע הזרקות מיד לאחר הכנת החינון.
7. העבירו את הדגים הנגועים בנפרד ללוחות של 24 בארות המכילות 2 מ"ל לבאר מים ודגרו בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. עוברים שהוזרקו ב-1-3 nl 1X PBS יכולים לשמש כבקרה.
8. זיהום נכון של חיידקים פלואורסצנטיים בעוברים מנוטר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

4. כימות עומס חיידקים

1. קביעה באמצעות ספירת CFU
   1. בנקודת הזמן הרצויה, לאסוף קבוצות של עוברים נגועים (5 לכל מצב) בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל (עובר אחד לצינור), הרדמה קריו-אנסטטיזציה על ידי דגירה על קרח למשך 10 דקות, והמתת חסד באמצעות מנת יתר של טריקאין (300-500 מ"ג/ליטר)
   2. שטפו את העוברים פעמיים במים סטריליים וחולקו אותם בצינור חדש. ליז כל עובר עם 2% טריטון X-100 מדולל ב-1X PBST באמצעות מחט 26-G והומוגניזציה של ההשעיה עד לליסיס מלא. צנטריפוגה את המתלים והחזירו את הכדור ל-1X PBST עם 0.05% Tween 80. דילול סדרתי של ההומוגנטים מצופים על Middlebrook 7H10OADc ומושלמים עם BBL MGIT PANTA, כפי שהומלץ על ידי הספק.
      הערה: M. abscessus רגיש יותר לטיפול ב-NaOH מאשר M. marinum. ניתן להשיג בהצלחה ניקוי של ליזטים של דגים מבלי לפגוע בצמיחת מורסות M. abscessus באמצעות קוקטייל האנטיביוטיקה BBL MGIT PANTA.
   3. דגרו את הצלחות במשך 4 ימים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס וספרו מושבות.

תוצאות

איור 1. הכנת M . abscessus inocula מפוזר.צביעת Ziehl-Neelsen של וריאנטים של R או S שגודלו על מדיום ציר לפני כל טיפול (פאנלים עליונים) או לאחר טיפול (פאנלים תחתונים) כדי להפחית את גודל ומספר האגרגטים המיקובקטריאל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
BBL MGIT PANTA	BD ביוסיינסס	245114
אלבומין סרום בקר	יורומדקס	04-100-811-E
קטלאז מ-Cowine Liver	סיגמא-אלדריץ'	C40
דיפקו מידלברוק 7H10 אגר	BD ביוסיינסס	262710
מרק דיפקו מידלברוק 7H9	BD ביוסיינסס	271310
מלח מתאנסולפונאט אתיל 3-אמינובנזואט (טריקאין)	סיגמא-אלדריץ'	A5040
חומצה אולאית	סיגמא-אלדריץ'	O1008
פאראפורמלדהיד	מיקרוסקופיית דלתא	15710
פנול אדום	סיגמא-אלדריץ'	319244
טווין 80	סיגמא-אלדריץ'	P4780
אגר	Gibco Life Technologie	30391-023
אגרוז עם התכה נמוכה	סיגמא-אלדריץ'
מלחי ים מיידיים באוקיינוס	מערכות אקווריום בע"מ
נימי זכוכית בורוסיליקט	סאטר אינסטרומנט בע"מ	BF100-78-10	1 מ"מ O.D. X 0.78 מ"מ זיהוי
מכשיר מושך מיקרופיפטות	סאטר אינסטרומנט בע"מ		מושך מיקרופיפטות חום p-87
מיקרואינג'קטור	טריטק ריסרץ'		מיקרו-אינג'קטור דיגיטלי, MINJ-D
פינצטה	סיינס טולס בע"מ		דומון # M5S
טיפים למיקרולודר	אפנדורף