מידול פתוגנזה של Aeromonas ב-C. elegans באמצעות מבחן הישרדות

תקציר

מקור: צ'ן, י. ואחרים. הערכת אלימות ופתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)

הסרטון הזה מדגים בדיקת הישרדות באמצעות C. elegans למידול פתוגנזה של Aeromonas , שבה בליעת חיידק דרך הפה מובילה לזיהום במעי ולמוות, ומאפשרת הערכה כמותית של אלימות חיידקית במערכת מארחת חיה.

פרוטוקול

1. מבחן הישרדות של C. elegans עם Aeromonas

1. ביום זריעת תולעי L1 על תולעת ENGM (תווך גידול נמטודות מועשר) המתפשטות עם E. coli OP50, בחרו מושבה אחת מכל אחד מארבעת זני Aeromonas או E. coli OP50 ותרבית עם מרק 2 מ"ל LB, בהתאמה, בטמפרטורה של 37°C למשך 16 שעות.
   הערה: כדי למנוע זיהום, שלב זה צריך להתבצע במכסה זרימה למינרי. כאן השתמשו בזני החיידקים הבאים: E. coli OP50, מקור המזון הרגיל של C. elegans. A. dhakensis AAK1, הבידוד הקליני הפתוגנני הראשון עם רצף מלא של A. dhakensis . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 ו-A. caviae A2-9307121 הם מבודדים קליניים מייצגים מבית החולים הלאומי צ'נג קונג.
2. מדדו את ספיגת OD₆₀₀ (צפיפות אופטית ב-600 ננומטר) של ציר חיידקים והתאימו את ציר החיידקים_{ל-OD 600} = 2.0 עם ציר LB.
3. אתר ופיזר 30 מיקרוליטר של מרק חיידקים על כל צלחת NGM (מדיום גידול נמטודות) בקוטר 6 ס"מ. תגדלו את הצלחות בטמפרטורת החדר במהלך הלילה.
   הערה: להכנת NGM, יש להמיס 3 גרם NaCl (כלוריד נתרן), 2.5 גרם פפטון חיידקי ו-20 גרם אגר ב-1 ליטר מים דה-יוניים. אוטוקלאב ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. המתינו עד שהתקררו ל-55 מעלות צלזיוס באמבט מים ואז הוסיפו 1 מ"ל של 1 מ' CaCl₂ (כלוריד סידן), 1 מ"ל של 1 מ' MgSO₄ (סולפט מגנזיום), 1 מ"ל של 5% כולסטרול באתנול, ו-25 מ"ל בופר פוספט. לסובב כדי לערבב טוב.
4. ביום שבו תולעי L1 גדלות לשלב L4, בוחרות ומעבירות באקראי 50 תולעים ללוח NGM עם כל אחד מארבעת זני Aeromonas או E. coli OP50.
5. דגרו את לוחות ה-NGM בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד לסיום הבדיקה.
6. העבר את כל התולעים החיות ללוח NGM חדש שהוכנה עם חיידקים וספר את מספר התולעים החיים, המתות והחיישנים מדי יום עד שהתולעת האחרונה מתה.
   הערה: העבירו תולעים לפלטת NGM טרייה מדי יום לשמירה על זיהום, גם אם משתמשים בתולעים סטריליות (למשל, glp-4 או עם FudR).
7. צייר את עקומות ההישרדות בהתבסס על חישוב הנתונים היומי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חממת שייקר	יי דר	LM-570R	דגירה של חיידקים
NaCl	סיגמה	31434	הכנת מדיום תרבותי
MgSO₄	סיגמה	M7506	הכנת מדיום תרבותי
אגר	דיפקו	214530	הכנת מדיום תרבותי
CaCl₂	סיגמה	C1016	הכנת מדיום תרבותי
כולסטרול	סיגמה	C8503	הכנת מדיום תרבותי
פלטת פטרי בקוטר 6 ס"מ	אלפא פלוס	46	הכנת צלחת אגר
פפטון חיידקי	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	הכנת מדיום תרבותי
FudR	סיגמה	1271008	הכנת מדיום תרבותי
מערכת מיקרוסקופ	ניקון	Eclipase Ti הפוך	הדמיית מיקרוסקופ