הערכת אלימות חיידקית באמצעות בדיקת רעילות נוזלית של C. elegans

Abstract

מקור: צ'ן, י. ואחרים. הערכת אלימות ופתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

הסרטון הזה מדגים את מבחן רעילות נוזלית של C. elegans עם Aeromonas, שיטה המשמשת להערכת אלימות חיידקית על ידי מדידת הישרדות תולעים בסביבה נוזלית מוגבלת חומרים מזינים. הבדיקה חושפת פתוגניות ייחודית לזן בהתבסס על היקף הנזק והתמותה שנגרמו על ידי רעלים ב-C. elegans.

Protocol

1. בדיקת רעילות נוזלית של C. elegans עם Aeromonas

הערה: כדי למנוע זיהום, יש לבצע שלבים במכסה זרימה למינרי.

1. ביום שלאחר זריעת תולעי L1 על צלחת ENGM (מדיום גידול נמטודות מועשר) עם E. coli OP50, קטף מושבה אחת מכל אחד מארבעת זני Aeromonas ו-E. coli OP50, ותגדל עם ציר 5 מ"ל LB כל אחד בטמפרטורה של 37°C למשך 16 שעות.
   הערה: בפרוטוקול השתמשו בזני החיידקים הבאים: E. coli OP50, מקור המזון הרגיל של C. elegans. A. dhakensis AAK1, האיזול הקליני הפתוגני הראשון עם רצף מלא של A. dhakensis . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007, ו-A. caviae A2-9307121 הם מבודדים קליניים מייצגים מבית החולים הלאומי צ'נג קונג.  
   הערה: להכנת NGM מועשר (ENGM), יש להמיס 3 גרם NaCl, 5 גרם פפטון חיידקים, 1 גרם תמצית שמרים ו-30 גרם אגר בליטר מים דה-יוניים. אוטוקלאב ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. המתינו עד שהתקררו ל-55 מעלות צלזיוס באמבט מים, והוסיפו 1 מ"ל של 1 מ' CaCl₂, 1 מ"ל של 1 מ' MgSO₄, 1 מ"ל של 5% כולסטרול באתנול, ו-25 מ"ל בופר פוספט. לסובב כדי לערבב טוב.
2. מדד את ספיגת_{ה-OD 600} של מרק החיידקים.
3. צנטריפוגה את ציר החיידקים ב-3,500 x גרם למשך 15 דקות כדי להסיר את מרק ה-LB. החזירו את החיידקים והתאימו את מרק החיידקים ל-OD₆₀₀ = 3.0 עם מדיום S. הוסיפו 195 מיקרול ציר חיידקים במדיום S לפחות ל-8 בארות של צלחת עם 96 בארות.
   הערה: הרכב מדיום S: להכנת מדיום S, מערבבים 40 מ"ל בסיס S, 0.4 מ"ל 1 מ' אשלגן ציטראט, 0.4 מ"ל תמיסת מתכות עקבות, 0.12 מ"ל של 1 מ' CaCl₂, 0.12 מ"ל של 1 מ' MgSO₄, 40 מיקרוליטר של 5% כולסטרול באתנול ו-1 מ"ל 8 מ"מ פולט לפני השימוש.
4. שטוף את תולעי L4 על לוח ENGM עם E. coli OP5 עם M9 בינוני. כוונו את תמיסת התולעת לריכוז של 5 תולעים למיקרוליטר והוסיפו 5 מיקרוליטר של תמיסת התולעת לכל באר בלוח 96 הבארות. ודא שיש כ-25 תולעים בכל באר.
5. דגור את פלטת 96 הבארים על שייקר ב-200 סל"ד ב-25 מעלות צלזיוס.
6. ספרו את מספר התולעים החיות והמתות אחרי 24, 48 ו-72 שעות. חשב את שיעורי ההישרדות של כל באר באמצעות הנוסחה הבאה: (תולעים חיות/תולעים כוללות) × 100%.
7. צייר גרף פיזור עם חישוב הנתונים היומי.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
חממת שייקר	יי דר	LM-570R	דגירה של חיידקים
NaCl	סיגמה	31434	הכנת מדיום תרבותי
MgSO₄	סיגמה	M7506	הכנת מדיום תרבותי
אגר	דיפקו	214530	הכנת מדיום תרבותי
CaCl₂	סיגמה	C1016	הכנת מדיום תרבותי
כולסטרול	סיגמה	C8503	הכנת מדיום תרבותי
אתנול	סיגמה	32205	הכנת מדיום תרבותי
KOH	סיגמה	P5958	הכנת מדיום תרבותי
פלטת פטרי בקוטר 6 ס"מ	אלפא פלוס	46	הכנת לוחות אגר
לוח 96 בארות	פלקון	353072	בדיקה נוזלית
פפטון חיידקי	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	הכנת מדיום תרבותי
תמצית שמרים	סיגמה	92144	הכנת מדיום תרבותי
חומצה ציטרית•H₂O	סיגמה	בערך 1909	הכנת מדיום תרבותי
טרי-אשלגן ציטראט•H₂O	סיגמה	104956	הכנת מדיום תרבותי
FudR	סיגמה	1271008	הכנת מדיום תרבותי
די-סודיום EDTA	סיגמה	E1644	הכנת מדיום תרבותי
טריפטון	סיגמה	16922	הכנת מדיום תרבותי
מערכת מיקרוסקופ	ניקון	Eclipase Ti הפוך	הדמיית מיקרוסקופ
מצלמת CCD מדעית	QImaging	רטיגה-2000R פאסט 1394	הדמיית מיקרוסקופ