בדיקת נמק שרירים ב-C. elegans שנגרמה על ידי זן פתוגני של Aeromonas

תקציר

מקור: צ'ן, י. ואח', הערכת אלימות ופתוגנזה של זיהום אירומונאס במודל Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)

הסרטון הזה מדגים בדיקת נמק שריר ב-C. elegans (Caenorhabditis elegans) באמצעות זני Aeromonas פתוגניים. על ידי הזנת תולעים מבטאות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) על צלחות עם זרעי Aeromonas, הבדיקה מדמה זיהום חיידקי וחושפת נזק לרקמה באמצעות הדמיית פלואורסצנציה. אובדן הדרגתי של מבנה השריר ואות ה-GFP מצביע על תגובה נקרוטית שנגרמה על ידי Aeromonas.

פרוטוקול

1. בדיקת נמק שריר Caenorhabditis elegans עם Aeromonas

הערה: כדי למנוע זיהום, יש לבצע את השלבים הללו במכסה זרימה למינרי.

1. ביום שבו תולעי L1 מוזרעות על מדיום הצמיחה העשיר של נמטודות (ENGM) שהתפשט עם Escherichia coli OP50, יש לקטוף מושבה אחת מכל אחד מארבעת זני Aeromonas ו-E. coli OP50 ותרבית עם ציר 2 מ"ל Luria-Bertani (LB) כל אחד בטמפרטורה של 37°C למשך 16 שעות. הערה: כאן נעשה שימוש בזני החיידקים הבאים: E. coli OP50, מקור המזון הנורמלי של C. elegans. A. dhakensis AAK1, האיזול הקליני הפתוגני הראשון עם רצף מלא של A. dhakensis. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 ו-A. caviae A2-9307121 הם מבודדים קליניים מייצגים מבית החולים הלאומי צ'נג קונג.
2. מדדו את ספיגת_{ה-OD 600} של ציר החיידקים והתאימו את ציר החיידקים_{ל-OD 600} = 2.0 עם ציר LB. לאתר ולפיזר 30 מיקרו-ליטר של מרק חיידקים על פלטות NGM בגודל 6 ס"מ. תגדלו את הצלחות בטמפרטורת החדר במהלך הלילה.
3. ביום שבו תולעי L1 גדלות לשלב L4, מעבירים 50 תולעים לכל לוח NGM עם כל אחד מארבעת זני Aeromonas או E. coli OP50. דגרו את לוחות ה-NGM בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. העבירו תולעים כל 24 שעות לצלחות NGM שהוכנו לאחרונה עם חיידקים.
4. צלם תמונות שרירים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
   1. תבחר באקראי 10 תולעים על ג'ל אגרוז 2% במידה M9 בינונית, על סלייד. השתק את התולעים באמצעות 2 מיקרוליטר נתרן 1% אזיד ב-M9 על אגרוז למשך פחות מ-5 דקות לפני צילום התמונה.
   2. הנח כיסוי וצילם את תמונות השרירים באמצעות פילטר חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) על מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מצלמת מכשיר עם מטען. צלם את תמונות השרירים ב-24, 48 ו-72 שעות אחרי שלב L4.

בצע ניתוח תמונה והכנת דמות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה.
הערה: הגדרות הניקוד ורמות הנזק לשרירים מוצגות באיור 1, שבו הקריטריונים מפורטים כך: 3 נקודות על סיבי שריר חסרים; 2 נקודות עבור סיבי שריר קרועים או שבורים; נקודה אחת לסיבי שריר כפופים; 0 נקודות על סיבי שריר בריאים.

תוצאות

איור 1: הציונים המתאימים לנמק שרירים ב-C. elegans שנגרם על ידי זיהום Aeromonas. הקריטריונים לנמק השריר והציונים המתאימים הם כדלקמן: 3 נקודות על סיבי שריר חסרים; 2 נקודות ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חממת שייקר	יי דר	LM-570R	דגירה של חיידקים
K₂HPO₄	ג'יי.טי. בייקר	MP021519455	הכנת מדיום תרבותי
KH₂PO₄	ג'יי.טי. בייקר	3246-05	הכנת מדיום תרבותי
Na₂HPO₄	ג'יי.טי. בייקר	MP021914405	הכנת מדיום תרבותי
NaCl	סיגמה	31434	הכנת מדיום תרבותי
MgSO₄	סיגמה	M7506	הכנת מדיום תרבותי
אגר	דיפקו	214530	הכנת מדיום תרבותי
CaCl₂	סיגמה	C1016	הכנת מדיום תרבותי
כולסטרול	סיגמה	C8503	הכנת מדיום תרבותי
אתנול	סיגמה	32205	הכנת מדיום תרבותי
KOH	סיגמה	P5958	הכנת מדיום תרבותי
פלטת פטרי בקוטר 6 ס"מ	אלפא פלוס	46	הכנת צלחת אגר
פפטון חיידקי	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	הכנת מדיום תרבותי
תמצית שמרים	סיגמה	92144	הכנת מדיום תרבותי
חומצה ציטרית•H₂O	סיגמה	בערך 1909	הכנת מדיום תרבותי
טרי-אשלגן ציטראט•H₂O	סיגמה	104956	הכנת מדיום תרבותי
FudR	סיגמה	1271008	הכנת מדיום תרבותי
די-סודיום EDTA	סיגמה	E1644	הכנת מדיום תרבותי
FeSO₄·7H₂O	סיגמה	215422	הכנת מדיום תרבותי
MnCl₷4H₂O	סיגמה	221279	הכנת מדיום תרבותי
ZnSO₄·7H₂O	סיגמה	204986	הכנת מדיום תרבותי
CuSO₄·5H₂O	סיגמה	C8027	הכנת מדיום תרבותי
טריפטון	סיגמה	16922	הכנת מדיום תרבותי
מערכת מיקרוסקופ	ניקון	Eclipase Ti הפוך	הדמיית מיקרוסקופ
מצלמת CCD מדעית	QImaging	רטיגה-2000R פאסט 1394	הדמיית מיקרוסקופ