ייצוב בתיווך סיבי קרלי של דפוסי הידרוג'ל חיידקיים

תקציר

מקור: Spiesz, E. M. ואחרים, דפוסים תלת-ממדיים של ביופילמים מהונדסים עם מדפסת ביולוגית עשה-זאת-בעצמך. J. Vis. Exp. (2019)

הסרטון הזה מדגים שיטה להשוואת דפוסי אלגינט מודפסים בתלת-ממד המכילים זני חיידקים מהונדסים גנטית או מבוקרים. הזן המבחן מייצר סיבי קרלי בעת ההשראה, שמחזקים את מבנה ההידרוג'ל האלגינט. לאחר טיפול בתמיסת סידן מכיל, רק דפוס הבדיקה נשאר שלם, מה שמדגיש את האפקט המייצב של ייצור סיבי הקרלי.

פרוטוקול

1. 3D תהליך הדפסה

1. התקן ופתח את תוכנת ההדפסה התלת-ממדית (טבלת חומרים) במחשב. חבר את מדפסת התלת-ממד למחשב. הזז את ראש ההדפסה למיקומו הביתי על ידי לחיצה על כפתור הבית של צירי X, Y ו-Z.
2. לכל הדפסה, הניחו מצע הדפסה מוכן על מיקום מסוים במשטח ההדפסה.
3. כיילן את גובה ראש ההדפסה בציר Z.
   1. הרם את ראש ההדפסה לגובה של 22 מ"מ תחת שליטה ידנית, כדי שלא יתנגש בקצה צלחת הפטרי בעת תנועה למיקום הרצוי. מקם את ראש ההדפסה מעל הלוח, והזיז אותו כלפי מטה עד שקצה הפיפטה נוגע במשטח ההדפסה. הקצה את מיקום ציר ה-Z כ-Z1 (גובה משטח ההדפסה).
   2. הרם את ראש ההדפסה, והזיז אותו מחוץ לאזור הלוח באמצעות שליטה ידנית בצירים X, Y ו-Z. אם מרחק העבודה בין ראש ההדפסה למשטח הפלטת מוגדר כ-Z2, הזן את Z1 + Z2 בתוכנית ההדפסה כערך Z במהלך ההדפסה.
4. תכנת את צורת ההדפסה בשיטה נקודה לנקודה שנקבעה בעצמך לפי המסלול הרצוי.
   1. אם המסלול הרצוי הוא קו ישר, הגדר רק את נקודות ההתחלה והסיום. הוספת נקודות נוספות על קווים מעוקלים תוביל לעקומות חלקות יותר. העבר את ראש ההדפסה ידנית לכל נקודה ברצף, ורשום את הקואורדינטות של הנקודות לפי הסדר. הזן את כל הקואורדינטות הללו וכן את מהירות התנועה של ראש ההדפסה לכל קטע מודפס לעורך קוד G.
5. לפני ואחרי ההדפסה, הרם את ראש ההדפסה למרחק גבוה יותר מקצה הפלטה (20 מ"מ), והתקדם ישירות מחוץ לאזור הלוח. שמרו את התוכנית כקובץ קוד G וטענו ישירות לשימוש בהדפסות הבאות, תוך מדידה מחדש של גובה ציר ה-Z עבור כל מצע הדפסה חדש.
   הערה: ראו טבלה 1 לדוגמה קוד G להדפסת ריבוע.
6. טען את קובץ הקוד G המתוכנת מראש. פתח את עורך קוד ה-G בתוכנה, ותכנת את הפקודות להדפסת הצורה הרצויה. בכל שורת פקודה, מיקום ראש ההדפסה יכול להשתנות בציר X, Y ו/או Z. הזן את ערך ה-Z בכל שלבי ההדפסה כ-Z1 + Z2 (גובה משטח ההדפסה + מרחק עבודה).
   הערה: מהירות התנועה גם ניתנת לכוונון; 9,000 מ"מ לדקה הוא ערך מתאים לקצב הדפסה טיפוסי.
7. טעין את הביו-דיו הנוזלי לתוך מזרקים, והתקן אותם במשאבת המזרק של הביופרינטר התלת-ממדי.
8. הדפיסו את הביו-דיו על מצע ההדפסה על ידי לחיצה על כפתור ההדפסה.
9. במהלך ההדפסה, שלוט לחלוטין בתנועת ראש ההדפסה באמצעות התוכנה. הפעל ידנית את משאבת המזרק לפני שראש ההדפסה נוגע במשטח ההדפסה.
   הערה: התיאום בין משאבת המזרק למדפסת נקבע אמפירית בהתאם למהירות האקסטרוזיה, למהירות תנועת ראש ההדפסה לנקודת ההדפסה הראשונה, ולמיקום ההתחלתי של ראש ההדפסה. אם מיקום ראש ההדפסה ההתחלתי הוא 20 מ"מ, עם מהירות ראש הדפסה של 9,000 מ"מ לדקה ומהירות אקסטרוזיה של 0.1 מ"מ לשעה, הפעל את משאבת המזרק מיד לאחר תחילת ההדפסה. אם מהירות האקסטרוזיה משתנה מ-0.1 מ"ל לשעה ל-0.3 מ"ל לשעה, יש להמתין 2−3 שניות להפעלת משאבת המזרק לאחר תחילת ההדפסה.
10. עצור את משאבת המזרק ברגע שראש ההדפסה מגיע לנקודת ההדפסה האחרונה. עצור את משאבת המזרק לפני שראש ההדפסה מתרומם בסוף תהליך ההדפסה, אחרת ביודיו עודף ייפול על מצע ההדפסה ויקטין את רזולוציית ההדפסה.
11. לבניית מבנים תלת-ממדיים, יש לשלוט בכל תנועות ראש ההדפסה בעורך קוד G. הקלד את גובה ההדפסה של השכבה הראשונה. הגדילו את ערך ה-Z בקוד G ב-0.2 מילימטרים לשכבה השנייה כדי להגדיל את גובה ההדפסה. לאחר מכן, הגדילו את ערך ה-Z ב-0.1 מילימטרים בעת מעבר לשכבה גבוהה יותר. אל תזיז את הפלטת במהלך תהליך ההדפסה.
12. כדי למדוד את רוחב וגובה ההידרוג'ל המודפס, יש להשתמש בסרגל פלדה המונח מתחת או לצד הדגימה.

2. גידול ובדיקת יעילות ייצור ביופילם על ידי E. coli

1. דגרו את הדגימות המודפסות בטמפרטורת החדר למשך 3−6 ימים כדי לאפשר ייצור רכיבי ביופילם (סיבי קרלי). דמיין את הלוחות באמצעות מצלמה או סורק פלואורסצנטי.
2. כדי להמיס את מטריצת האלגינט, הוסף 20 מ"ל של תמיסת נתרן ציטראט 0.5 מ' (pH = 7 מותאם עם NaOH) למצעי ההדפסה, ודגר במשך 2 שעות עם ניעור של 30 סל"ד בטמפרטורת החדר. להשליך את הנוזל ולצלם שוב את הצלחות כדי להשוות לתמונות של הצלחות לפני הטיפול בציטראט.

טבלה 1: תהליך תכנות והסברים על קוד G להדפסת ריבוע.

פקודות G-code	משימות
G1 Z20 F9000	הרם את ציר ה-Z לגובה של 20 מ"מ עם מהירות תנועה של 9,000 מ"מ לדקה.
G1 X95 Y65 F9000	עברו לנקודת ההתחלה של השורה הראשונה במהירות תנועה של 9,000 מ"מ לדקה.
G1 Z6 F9000	התקדם כלפי מטה בכיוון Z למרחק הדפסה נכון (כאן Z = 6 מ"מ).
G1 X95 Y105 F300	נקודת הסיום של השורה הראשונה ונקודת ההתחלה של השורה השנייה.
G1 X135 Y105	נקודת הסיום של השורה השנייה ונקודת ההתחלה של השורה השלישית.
G1 X135 Y65	נקודת הסיום של השורה השלישית ונקודת ההתחלה של השורה הרביעית.
G1 X95 Y65	נקודת הסיום של השורה הרביעית ונקודת ההתחלה של השורה הראשונה; נוצר ריבוע.
G1 Z20 F9000	הרם את ציר ה-Z לגובה של 20 מ"מ במהירות של 9,000 מ"מ לדקה.
G1 X55 Y40 F9000	עבור לקואורדינטה (55, 40) מחוץ לטווח צלחת פטרי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אבקת מרק LB	סיגמא-אלדריץ'	L3022
מתנער מסלולי	VWR	89032-092	דגם 3500
צלחת פטרי	VWR	25384-326	150 x 15 מ"מ
רמנוז	סיגמא-אלדריץ'	83650
צינורות סיליקון	VWR	דן 3100103/25
משאבת מזרק	ProSense B.V.	NE-300
אלגינט נתרן	סיגמא-אלדריץ'	W201502
נתרן ציטראט מונובסיסי	סיגמא-אלדריץ'	71498
נתרן הידרואוקסיד	VWR	28244.295