1. הקמת מיקרוסקופ ורכישת טיים-לאפס
הערה: הפרוטוקול המתואר כאן פותח עבור מיקרוסקופ רחב-שדה הפוך עם פוקוס אוטומטי, מטרה PH3 בשמן NA 100X/1.30, שלב ממונע X, Y, מצלמת sCMOS, מקור אור, מסננים לחלבונים פלואורסצנטיים ירוקים, אדומים פלואורסצנטיים או צהובים, ותא דגירה מבוקר טמפרטורה. תא זה שומר על תאים מוגנים מאור ובטמפרטורה קבועה.
- חממו מראש את תא הדגירה ואת המיקרוסקופ ל-32 מעלות צלזיוס למשך ~1 - 2 שעות לפני תחילת המיקרוסקופיה.
הערה: בהתאם למערכת המיקרוסקופ, החימום עשוי לקחת יותר זמן. חימום מוקדם חיוני להפחתת סטייה ומייצב את מערכת הבקרה האוטומטית. - הפעל את המיקרוסקופ והפעל את תוכנת בקרת המיקרוסקופ. בחר את המטרה הנכונה ואת המראות והמסננים הנכונים כדי לצלם תמונות ניגודיות פאזה וכן תמונות של חלבונים ירוקים-פלואורסצנטיים, אדומים פלואורסצנטיים או צהובים-פלואורסצנטיים.
הערה: מיקרוסקופ מסופק בדרך כלל עם תוכנה מועדפת לשליטה במיקרוסקופ ורכישת תמונה. כאן, תוכנה זמינה מסחרית (ראו טבלת החומרים) שימשה לשליטה במיקרוסקופ וברכישת התמונה. - הוסיפו טיפה של שמן טבילה איכותי לעדשת האובייקטיב ולתחתית הדגימה, המוקדמת בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס. הניחו את האובייקטיב במיקום Z הנמוך ביותר כדי למנוע נזק כאשר הדגימה מונחת על שלב המיקרוסקופ. הניחו את המסגרת המתכתית עם הדגימה על שלב המיקרוסקופ, כאשר ה"צד החור" פונה לאובייקטיביה. מהדק את הדגימה היטב במחזיק הבמה.
- התמקד בתאים על ידי הזזת הבמה בכיוון Z קרוב יותר למטרה. הזז את הבמה לאט כשהשמן נופל על הצד התחתון של הדגימה והעדשה האובייקטיבית נוגעת. הזז את הבמה בכיוון X/Y עד שמספר תאים בודדים נראים באזור הראייה, כאשר התאים נמצאים במישור המוקד. ודא שלפחות מיקרוספירה פלואורסצנטית אחת נמצאת באזור הראייה כדי ליישר את התמונות שנרכשו מאוחר יותר.
הערה: בתנאים אופטימליים, יש להגיע לצפיפות תאים של 15 - 30 תאים לכל אזור ראייה (2,048 x 2,048 פיקסלים או 133.1 x 133.1 מיקרון). - פתח את אשף הרכישה הרב-ממדית של תוכנת בקרת המיקרוסקופ כדי להקים ניסוי טיים-לאפס שמאפשר למיקרוסקופ לצלם תמונות באורכי גל שונים ובמיקומי שלבים במידת הצורך.
- בלשונית הראשית, הפעל Timelapse ומספר אורכי גל. טאבים נוספים יופיעו בצד שמאל של החלון.
- לחץ על לשונית השמירה ובחר תיקייה כדי לבחור תיקייה ריקה בכונן הקשיח של המחשב ולשמירת התמונות שנרכשו. הפעל את שם הבסיס של תוספת אם קיים קובץ כדי לוודא שמאגרי נתונים עוקבים לא מחליפים את הקודמים. לאחר מכן תן לניסוי שם עם תאריך ושם הזן או שם הניסוי.
- לחצו על לשונית Time-lapse כדי להתאים את פרמטרי ה-timelapse. הגדר את משך הזמן ל-24 שעות וקבע את מרווח הזמן ל-20 דקות. מספר נקודות הזמן ישתנה אוטומטית.
הערה: מרווח הזמן האופטימלי תלוי בניסוי ובפונקציית התא שיש לנתח. רכישת תמונות תכופות עלולה לגרום להלבנת פוטו. לכן, יש למצוא פשרה אמפירית בין רזולוציה זמנית לפוטובליצ'ינג. בזמן הכפלה של 4 - 6 שעות, ניתן לצלם תמונות בקלות במרווח של 5 דקות (או אפילו מרווחים קטנים יותר אם רוצים) עבור מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה. אם רוצים מיקרוסקופיה פלואורסצנצית לאורך זמן של 24 שעות, יש להקליט תמונות במרווח של כ-15 עד 30 דקות. - לחצו על לשונית Wavelengths . בחר את מספר אורכי הגל שיש לרכוש עבור כל תמונה בכל נקודת זמן על ידי שינוי המספר.
הערה: לכל אורך גל, תופיע לשונית חדשה בצד השמאלי של אשף הרכישה הרב-ממדית" ואורכי הגל ייאספו בסדר מלמעלה למטה. לכל אורך גל, ניתן לשנות את הגדרות הרכישה בנפרד. - לחצו על לשונית אורך הגל הראשונה מלמעלה. בחר ניגודיות פאזה ברשימת ההארה הנפתחת. בחר 100 מילישניות לחשיפה ובחר בכל נקודת זמן ברשימת הרכישה הנפתחת. כבה את החשיפה האוטומטית על ידי בחירת 'לעולם לא ' ברשימת הנפתחים.
- חזור על שלב 3.5.5 עבור כל אורך גל שצריך לרכוש בכל נקודת זמן. למערך הניסויי ולחלבונים מסומנים פלואורסצנטית המתוארים כאן, השתמשו בפרמטרים הבאים לחשיפה: 250 מילישניות לחלבוני מיזוג mCherry, 200 מילישניות לחלבוני מיזוג YFP (חלבון פלואורסצנטי צהוב), ו-1,000 מילישניות לחלבוני מיזוג GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק).
הערה: הגדרות התאורה האופטימליות לכל זן וחלבון פלואורסצנטי צריכות להיקבע מראש על ידי שינוי עוצמת המנורה וזמן רכישת התמונה לכל אורך גל. זמן רכישת תמונה ארוך מדי יגביר את האפקט הפוטוטוקסי ובסופו של דבר יוביל לעצירת גדילה ומוות תאים. לכן, יש להשיג פשרה בין איכות התמונה ליכולת התא. - לצלם תמונות ממספר עמדות במה כדי להגדיל את מספר התאים שנרשמו באותו ניסוי.
- כדי להשיג תמונות ממספר מיקומי שלבים, הפעל את Multiple Stage Positions בלשונית הראשית . לאחר מכן לחץ על לשונית הבמה ולחץ על כפתור ההופעה כדי להסתכל על שדה התצוגה.
- הזיזו את הבמה בכיוון X/Y עד שאזור עניין (ROI) נמצא בשדה הראייה. שמור את קואורדינטות ה-X וה-Y על ידי לחיצה על "+" בלשונית הבמה . הזז את השלב שוב בכיוון X/Y עד שנמצא ROI חדש ושמור את הקואורדינטות שוב על ידי לחיצה על "+". המשיכו עד שמספר האזורים הרצוי יישמר.
הערה: במקרה של רכישת תמונה פלואורסצנטית, ודא שאזורי העניין (ROIs) אינם קרובים מדי זה לזה כדי למזער פוטוטוקסיות.
- בדוק שוב שהתאים בפוקוס על ידי לחיצה על מיקומי X ו-Y השמורים, והתחל את הפוקוס האוטומטי של החומרה על ידי לחיצה על AFC hold כדי לשמור על מיקום Z השמור קבוע במהלך הניסוי.
- התחל את הקלטות הטיימלפס בתוכנת בקרת המיקרוסקופ על ידי לחיצה על Acquire באשף רכישה רב-ממדית .
הערה: חלון אחד יופיע עבור כל אורך גל שנרכש, וחלון נוסף שמראה את מספר נקודות הזמן שנרכשו ואת הזמן עד לרכישת התמונה הבאה. - בדוק שהתאים עדיין בפוקוס אחרי כמה נקודות זמן ראשונות בהקלטות הטיימלפס כדי למקסם את איכות התמונות ולמיקוד מחדש במידת הצורך.