דימות טיימלפס בתאי חיים של טורפות בקטריובורוס של Bdellovibrio על E. coli

תקציר

מקור: Makowski, Ł., ואחרים. הדמיה של תאים חיים של טורף חיידקי Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה בזמן-לפס. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים הדמיית פלואורסצנציה בזמן אמת של חיידק בדלוביבריו הטורף E. coli מקובע מתחת לכרית אגרוז, ומאפשר הדמיה בזמן אמת של שכפול תוך-תאי ושחרור צאצאים לצורך חקר טורף חיידקים ואינטראקציות בין מאכסן-פתוגנים.

פרוטוקול

1. הולכת מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בזמן-לאפס

1. הנח את הצלחת בקוטר 35 מ"מ במחזיק הצלחות פטרי כך שלא תזוז במהלך הניסוי. מניחים טיפה אחת של שמן טבילה (מקדם שבירה 1.518) על האובייקטיב וגם על תחתית הצלחת בקוטר 35 מ"מ.
2. התקן את המחזיק על הבמה של המיקרוסקופ ההפוך בתא המיקרוסקופ.
3. הגדר את האפשרויות בתוכנת בקרת המיקרוסקופ כדי לאסוף תמונות מרובות במיקומי שלבים שונים לאורך זמן.
   1. הגדר את ההגדלה (100x) ואת העדשה הפוליכרומית (GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק)/mCherry). באמצעות עינית ו-brightfield (BF), מצא את מישור המוקד ופתח את מנהל רשימת הנקודות.
   2. בחר לפחות 10 מיקומים מעניינים על ידי הזזת הבמה ואחסון הקואורדינטות של כל מיקום בתוכנת המיקרוסקופ על ידי לחיצה על כפתור סימון נקודה . הימנעו ממיקומים הקרובים זה לזה כדי למנוע הלבנה ופוטוטוקסיות. סובב את שסתום המצלמה מהעינית למסך וכייל כל נקודה על ידי הגדרת מישור המוקד ולחיצה על כפתור החלפת הנקודה במנהל רשימות הנקודות.
   3. פתח את מעצב הניסוי והגדר את כל פרמטרי הניסוי בכל לשונית כך:
      1. הסר את סימון תיבת ה-Z-stacking .
      2. בחר ערוצי פלואורסצנט וקבע את הגדרות התאורה האופטימליות. כאן נעשה שימוש בהגדרות הבאות: עבור ערוץ mCherry, ערכות פילטר mCherry (EX575/25; EM625/45), עוצמה של 50% וזמן חשיפה של 200 מילישניות; עבור ערוץ ה-GFP, סט מסנני GFP (EX475/28; EM525/48), עוצמה של 50% ו-80 ms; ובתמונות BF, ערוץ POL, עוצמה של 5% ו-50 ms.
      3. בחר מרווחים בין רכישת התמונות לבין הזמן הכולל של הניסוי. כאן, בוצעו מרווחים של 5 דקות במשך 10 שעות הניסוי.
      4. הפעל תחזוקת פוקוס למיקומים שנבחרו (עבור המערכת שבה משתמשים כאן, על ידי סימון תיבת הסימון Preserve Focus עם UltimateFocus ).
      5. בחר את תיקיית הנתונים שבה קבצי התמונה אמורים להישמר אוטומטית.
      6. בדוק מחדש את כל ההגדרות בבקרת תוכנת המיקרוסקופ, ואז התחל את ניסוי הטיימלפס.
4. לאחר השעה הראשונה של הניסוי, בדוק שכל מיקומי הבמה עדיין בפוקוס. כוון את המיקוד במהלך מרווחי הזמן בין רכישת התמונה, במידת הצורך.
5. לאחר סיום ניסוי הטיימלפס, הסר את צלחת פטרי והשתמש בצלחת 35 מ"מ עם כרית אגרוזה בהתאם לפרוטוקול הבטיחות הביולוגית.
   הערה: כל תת-השלבים לאחר שלב 1.2 מיועדים למשתמשי DeltaVision Elite. חוקרים המשתמשים במערכות אחרות צריכים להתאים את ההגדרות בהתאם למערכות הבודדות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ביולוגיה מולקולרית מוסמכת אגרוז	ביו-ראד	161-3100	אגרוז פלואורסצנציה נמוכה עבור רפידת אגרוז
פיג'י	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	חבילת עיבוד תמונה בקוד פתוח
צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ	איבידי	81218-200	זכוכית לא מצופה
מיקרוסקופ	GE	דלתה-ויז'ן אליט	שלב מיקרוטיטר, מודול לייזר אולטימטיבי פוקוס, מצלמת DV Elite CoolSnap HQ2, SSI מכלול FP DV, ערכת אוברסיטה. שמן Oly 100x 1.4 NA, פריזמה Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
התחל את SoftWoRx	GE		תוכנת הדמיה שסופקה על ידי היצרן