הדמיית התפלגות חלבוני חיידק בשלושה ממדים באמצעות הדמיית פלואורסצנציה

תקציר

מקור: ברטון, ב. פ. ואחרים, הדמיה תלת-ממדית של תאי חיידק לייצוגים תאיים מדויקים ומיקום חלבונים מדויק. J. Vis. Exp. (2019)

הסרטון הזה מדגים את השיטה לרכישת וניתוח תמונות פלואורסצנציה תלת-ממדיות של תאי חיידק כדי לחקור ארגון חלבונים ברמת התא היחיד.

פרוטוקול

1. הדמיה

1. הכנס את הסלייד האטום למיקרוסקופ ומאפשר לו לעמוד 5 דקות כדי לאזן את הטמפרטורה עם הסביבה. חדר המיקרוסקופ עשוי להיות בטמפרטורה שונה מחדר הכנת הדגימות.
2. קח ערימת Z פלואורסצנטית של הדגימה.
   הערה: ערימת ה-z צריכה לכסות לחלוטין את הדגימה עם מרווח z קטן מעומק השדה. עבור תאי E. coli בעובי 1.45 NA 100x ובעובי ~1 מיקרון, 40 צעדים במהירות 100 ננומטר לכל שלב עובדים היטב. לתאים גדולים יותר או תאים שאינם שוכבים שטוחים לחלוטין על פני השטח, ייתכן שיהיה צורך ב-50 שלבים או יותר. כלול מספיק שלבים וודא שהדגימה מטושטשת לחלוטין מעל ומטה.
   1. השתמשו בתוכנה המשויכת למיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגרוז	סיגמא-אלדריץ'	A9539
מטלית כותנה	Puritan Medical Products Company LLC	S304659	רגיל ל-Appy VaLaP
החלקות כיסוי	VWR	16004-302
פיג'י	ImageJ	https://fiji.sc	משתמשים ב-cro תאים
לנולין	סיגמא-אלדריץ'	L7387	שילוב עם פרפין וז'לי נפט כדי ליצור VaLaP
מדיום גידול LB	BD Difco	DF0446173
M63 בינוני	ביולוגי אמריקאי	M1015
MATLAB	מת'וורקס		נדרש להריץ סקריפטים קדימה של קונבולוציה
שקופיות מיקרוסקופ	פישר	12-550-133
אלמנטים של NIS	נקון
פרפין	סיגמא-אלדריץ'	327212
ג'לי נפט	אקווייט	49035-038-27
שלב פיזו z	ניקון	77011589
טיפים לפיפט - p200	USA Scientific	1111-0730
טיפים לפיפט - עמוד 10	USA Scientific	1111-3730