הדמיית התפלגות חלבוני חיידק בשלושה ממדים באמצעות הדמיית פלואורסצנציה

Abstract

מקור: ברטון, ב. פ. ואחרים, הדמיה תלת-ממדית של תאי חיידק לייצוגים תאיים מדויקים ומיקום חלבונים מדויק. J. Vis. Exp. (2019)

הסרטון הזה מדגים את השיטה לרכישת וניתוח תמונות פלואורסצנציה תלת-ממדיות של תאי חיידק כדי לחקור ארגון חלבונים ברמת התא היחיד.

Protocol

1. הדמיה

1. הכנס את הסלייד האטום למיקרוסקופ ומאפשר לו לעמוד 5 דקות כדי לאזן את הטמפרטורה עם הסביבה. חדר המיקרוסקופ עשוי להיות בטמפרטורה שונה מחדר הכנת הדגימות.
2. קח ערימת Z פלואורסצנטית של הדגימה.
   הערה: ערימת ה-z צריכה לכסות לחלוטין את הדגימה עם מרווח z קטן מעומק השדה. עבור תאי E. coli בעובי 1.45 NA 100x ובעובי ~1 מיקרון, 40 צעדים במהירות 100 ננומטר לכל שלב עובדים היטב. לתאים גדולים יותר או תאים שאינם שוכבים שטוחים לחלוטין על פני השטח, ייתכן שיהיה צורך ב-50 שלבים או יותר. כלול מספיק שלבים וודא שהדגימה מטושטשת לחלוטין מעל ומטה.
   1. השתמשו בתוכנה המשויכת למיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים) כדי לשלוט במיקרוסקופ.
   2. התמקדו במרכז התא באמצעות גלגלי המיקוד של המיקרוסקופ. ברכישת ND, סמן את תיבת Z כדי לקבל z-stack. לחץ על כפתור הבית כדי להגדיר את מרכז התא כנקודת התחלה. הגדר את גודל הצעד ל-0.1 מיקרון והגדר את הטווח ל-4 מיקרון. תוודא שמכשיר ה-Z מוגדר לשלב הפיאזו.
   3. הגדר את ערוצי הפלואורסצנט תחת חלון הלמבדה להגדרות של המולקולות הפלואורסצנטיות המדומות. בניסוי זה נעשה שימוש ב-GFP וב-mCherry.
      הערה: קחו ערימת z נוספת עם אותו גודל וטווח צעדים בערוץ הצבע השני אם רוצים התפלגות תלת-ממדית של ערוץ פלואורסצנטי נוסף. בניסוי זה, mCherry ציטופלזמי שימש לקביעת צורת התא ו-MreB-GFP שימש כערוץ צבע שני.
   4. ודא שסדר הניסוי מוגדר ל-lambda (סדרת z) כך שיקבל ערימת z מלאה בכל ערוץ צבע לפני המעבר.
   5. לחץ על Run Now כדי להתחיל את רכישת התמונה ולשמור את הקובץ לאחר שאחד או שני ה-z-stacks הושלמו.
   6. עברו לאזור חדש במשטח וחזרו על השלבים 1.2.2-1.2.5.

2. שחזור תאים

1. חתוך תאים בודדים ושמור את התמונות כקובץ tiff מוערם כך שיהיה רק תא אחד לכל קובץ. ודאו שתא זה מבודד היטב מכל תא אחר (כלומר, בערך פי 5 מחצי המקסימום ברוחב מלא של פונקציית הטשטוש ב-xy).
   הערה: ניתן לעשות זאת באמצעות תוכנת ניתוח תמונות חינמית (ראו טבלת חומרים).
   1. צייר תיבה סביב תא בודד ושכפל את התא הזה פעמיים, פעם אחת לכל ערוץ. תוודא שתיבת ה-duplicate hyperstack מסומנת ותשנה את הערוץ ל-1 או 2, תוך כדי שהפרוסות כוללות את כל ערימת ה-z.
      הערה: אם מדימים רק את צורת התאים ולא חלבון פלואורסצנטי נוסף, יהיה תעלה אחת בלבד.
   2. לאחר ששתי המחסניות זמינות, עבור לתמונות | ערימות | כלים | מחברים את התמונות כדי לשלב את התמונות תחילה עם ערוץ החלבון ואחר כך עם ערוץ הצורה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אגרוז	סיגמא-אלדריץ'	A9539
מטלית כותנה	Puritan Medical Products Company LLC	S304659	רגיל ל-Appy VaLaP
החלקות כיסוי	VWR	16004-302
פיג'י	ImageJ	https://fiji.sc	משתמשים ב-cro תאים
לנולין	סיגמא-אלדריץ'	L7387	שילוב עם פרפין וז'לי נפט כדי ליצור VaLaP
מדיום גידול LB	BD Difco	DF0446173
M63 בינוני	ביולוגי אמריקאי	M1015
MATLAB	מת'וורקס		נדרש להריץ סקריפטים קדימה של קונבולוציה
שקופיות מיקרוסקופ	פישר	12-550-133
אלמנטים של NIS	נקון
פרפין	סיגמא-אלדריץ'	327212
ג'לי נפט	אקווייט	49035-038-27
שלב פיזו z	ניקון	77011589
טיפים לפיפט - p200	USA Scientific	1111-0730
טיפים לפיפט - עמוד 10	USA Scientific	1111-3730