כימות עומס חיידקים במעי בדגי זברה הנגועים ב-Vibrio cholerae

תקציר

מקור: נג, ד. ואחרים. כימות קולוניזציה ושלשול של ויבריו כולרה במודל דגי זברה בוגרים. J. Vis. Exp. (2018)

הסרטון הזה מדגים פרוטוקול לכימות העומס החיידקי במעיים בדגי זברה בוגרים שנדבקו בזן עמיד לאנטיביוטיקה של Vibrio cholerae. לאחר המתת חסד ונתיחה, מערכת העיכול מבודדת, מתאחדת עם חרוזי זכוכית, ומעובדת לשחרור החיידקים. ההומוגנט המתקבל מצופה על מדיום סלקטיבי, ומושבות בצבע כחול המבטאות β-גלקטוזידאז נספרות כדי להעריך את נטל החיידקים.

פרוטוקול

1. קביעת רמות ההתיישבות במעיים

הערה: קולוניזציה במעי היא המדד השימושי ביותר במודל דגי הזברה, שכן ניתן להשתמש בה להשוואה בין הכושר היחסי של זנים שונים של V. cholerae או השפעות של מוטציות או הפחתות גנים.

1. המתת חסד

1. כאשר הניסוי הגיע לנקודת הסיום הרצויה, קחו דגימה ממי הזיהום (בדרך כלל 15 מ"ל מספיקים) כדי לאפשר ספירות חיידקים מופרשות ומדידת שלשול (כגון בדיקת מוצין, תכולת חלבונים ו/או מנת יתר), במידת הצורך.

2. שופכים את שארית המים דרך רשת דיג (לאיסוף הדגים) לתוך אקונומיקה כדי להרוג את V. cholerae במים.

3. הכניסו את הדג לבקבוק המכיל מים זיהומים, בנוסף ל-336 מיקרוגרם/מ"ל אתיל 3-אמינובנזואאט מתאנסולפונאט (טריקאין), ודגרו את הדג בתמיסת טריקאין זו למשך 20 דקות ב-RT.
הערה: הרשתות עברו חיטוי עם תמיסת אקונומיקה של 10%.

2. ניתוח

1. הכנת דגים

1. להוציא דג מתמיסת הטריקאין עם כף פלסטיק חד-פעמית ולהניח אותו על משטח הניתוח.

2. ממקמים את הדג כשהצד התחתון פונה כלפי מעלה ומצמידים אותו דרך הלסת התחתונה, כאשר הקצה הקהה של הסיכה בזווית הרחק ממרכז הגוף. שים סיכה נוספת ממש מאחורי פי הטבעת, גם היא בזווית הרחק מהגוף.

2. חשיפה למערכת העיכול

1. נגב את המשטח התחתון של הדג עם מגבון ללא סיבים טבול ב-70% אתנול.

2. לחטא אזמל ומספריים של ואנאס על ידי טבילה ב-70% אתנול ושריפה.

3. בצע חתך קטן לאורך הבטן ממש מתחת לעור על ידי חדירה לקשקשים ושימוש בסקלפל. היזהרו לא לחתוך עמוק מדי, שכן מערכת העיכול נמצאת ממש מתחת לעור.

4. באמצעות המספריים, האריך את החתך בזהירות לאורך הגוף, חתך לא עמוק יותר מגובה העור והימנע מפי הטבעת.

5. בצע שני חתכים צדדיים עם המספריים לכיוון ראש הדג כדי לאפשר פתיחה של החתך.

6. הצמיד את העור משני צידי החתכים הצדדיים למשטח הניתוח, בזווית הפינים החוצה, הרחק מהגוף.

הערה: קצות הסיכות עברו חיטוי קודם לכן על ידי הצתתן באלכוהול.

3. הסרת מערכת העיכול

הערה: מערכת העיכול צריכה להיות גלויה כצינור חיוור ודק מאוד מעל שאר האיברים.

1. לחטא את המלקחיים בלהבה ואז להשתמש בהם להסרת כל מערכת העיכול (בדרך כלל באורך 12–15 מ"מ). הניחו את המעי בצינור הומוגניזציה המכיל חרוזי זכוכית (ראו שלבים 1.3.1–1.3.2) ו-1 מ"ל של 1x PBS או LB, על קרח.

3. הומוגניזציה

1. הכינו את צינורות ההומוגניזציה מראש על ידי שפיכת ~1.5 גרם של חרוזי זכוכית בעובי 1 מ"מ לצינורות מכסה בורג בקוטר 2 מ"ל (מלאים אותם בערך עד חצי הדרך) ואז עיקורם באמצעות אוטוקלאב.

2. להוסיף 1 מ"ל של LB סטרילי או 1x PBS.

3. לאחר שהמעיים של דגי הזברה נוספו (שלב 1.2.3.1) לצינורות, הברגו את הפקקים חזק מאוד, ואז מאבטחים את הצינורות בהומוגניזר המערבולת.

4. הומוגניזציה של הדגימות למשך דקה אחת על ההגדרה המקסימלית, ואז מקררים אותן על קרח למשך 1–2 דקות. חזור על מחזור ההומוגניזציה הזה פעם נוספת להומוגניזציה מלאה. הערה: מספר שיטות חלופיות להומוגניזציה יעבדו גם כן.

4. כימות רמות ההתיישבות המעיים

1. הכינו צינורות (מבחנות זכוכית קטנות או צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל) לדילול סדרתי של ההומוגנט על ידי הוספת 900 מיקרוליטר LB או 1x PBS לכל צינור. לכל דג, יש להכין 5–6 צינורות ולבצע דילול סדרתי של 10 פעמים של ההומוגנט המעי על ידי הוספת 100 מיקרו ליטר של הומוגנט לצינור הראשון, ערבוב אותו לערבוב, ואז הוספת 100 מיקרוליטר מהצינור הראשון לשני.

2. חזור על ההליך הזה עד שכל הדילול מוכן.

3. לוח 100–200 מיקרוליטר מכל דילול על לוחות אגר LB המכילים 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (אם משתמשים בזנים עמידים לסטרפטומיצין) ו-40 מיקרוגרם/מ"ל של X-גלון (5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-β-D-גלאקטופירנוסיד). דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 16–18 שעות.

4. לאחר הדגירה הלילית, סופרים את מושבות V. cholerae על הלוחות, באמצעות מונה מושבות אוטומטי או ספירת מושבות ידנית; מומלץ לסמן את המושבות שנספרו עם קצה סימן.

5. קביעת ה-CFU למעי דג על ידי הכפלת מספר הלוחות בפקטור הדילול של המתלוי, תוך התחשבות בנפח שצופף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כלי נגינה
חממת שייקר	ניו ברונסוויק סיינטיפיק, אדיסון, ניו ג'רזי	אקסלה E25
חממה	נואייר, פלימות', מינסוטה	זרימה אוטומטית
ספקטרופוטומטר	תרמו, וולת'ם, מסצ'וסטס	גיאזיס 6
הומוגניזר מערבולת	Minibeadbeater24	112011
מכונת שקילה	אוהאוס, קולומביה, מרילנד	הרפתקן מקצועי
מערבל חום	קורנינג, קורנינג, ניו יורק	PC-420D
מבער
מונה מושבות אוטומטי	REVSCI	120417B
חומרים
כוסות זכוכית 400 מ"ל	פיירקס
מכסים מחוררים	מחזיק מיקרוטיפ עם חורים מתיבת הטיפ
כפות פלסטיק חד-פעמיות	אופיס דיפו, בוקה רטון, פלורידה	D15-25-7008
מערכת אקווריום הדגים	אקוונירינג, סן דייגו, קליפורניה
מטהר מים RO	אקווה אפקס	TK001
רשת דיג	מרינה
מזון לדגים	טטרה פין
שרימפס מלח	מותג הג'ונגל האדום	O.S.I. פרו 80
לוח קלקר
פינים
סכינים	כלים מדעיים טובים, פוסטר סיטי, קליפורניה	10000-10
מלקחיים	כלים מדעיים טובים, פוסטר סיטי, קליפורניה	11223-20
מספריים של ואנאס	כלים מדעיים טובים, פוסטר סיטי, קליפורניה	15000-11
צינורות מכסה בורג בקוטר 2 מ"ל	פישר סיינטיפיק, המפטון, ניו המפשייר	02-681-375
חרוזי זכוכית בגודל 1 מ"מ	מפרט ביולוגי	11079110
חרוזי זכוכית לפיזור	סיגמא, סנט לואיס, מיזורי	18406-500G
פלטת פטרי	פישר ברנד, המפטון, ניו המפשייר	FB0875713
צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל	Midsci, ואלי פארק, מיזורי	AVSS1700
צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל	קורנינג פלקון, קורנינג, ניו יורק	352098
מבחנות בדיקה	פיירקס	9820
פיפט זכוכית	פישר ברנד, המפטון, ניו המפשייר	13675K
מיקרופיפטות	סארטוריוס ביוהיט, גטינגן, גרמניה	M1000/M200/M20
טיפים	ג'נסי סיינטיפיק, סן דייגו, קליפורניה	24-150RS/24-412
כימיקלים
מלחי אוקיינוס מיידיים
מלח עם בופר עם פוספט	מדעי החיים של VWR, רדנור, פנסילבניה	K813-500ml
טריקאין (אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאנסולפונאט	סיגמא, סנט לואיס, מיזורי	A5040
LB בינוני
NaCl	פישר סיינטיפיק, המפטון, ניו המפשייר	BP358-212
אגר	BD ביוסיינס, סן חוזה, קליפורניה	214010
TCBS אגר	BD ביוסיינס, סן חוזה, קליפורניה	265020
DCLS אגר	סיגמא, סנט לואיס, מיזורי	70135-500 גרם
תוכנה
מיקרוסופט אופיס
פריזמה 5