התיישבות מעיים והשראת שלשול על ידי Vibrio cholerae בדגי זברה בוגרים

תקציר

מקור: נאג, ד., et.al. כימות קולוניזציה ושלשול של ויבריו כולרה במודל דגי זברה בוגרים. J. Vis. Exp. (2018)

הסרטון הזה מדגים את החיסון של דגי זברה בוגרים בזן פתוגני Vibrio cholerae כדי לחקור קולוניזציה במעי ותוצאות מחלות. הוא מראה כיצד רעלים חיידקיים מפריעים לשלמות המעי, מה שמוביל לדליפת נוזלים, הפרשת ריר ושלשול מימי לפני שהדגים מוכנים לניתוח נוסף.

פרוטוקול

1. חיסון דגי זברה בטבילה
   הערה: אמצעי החשיפה הזה דומה למהלך הטבעי של ההדבקה.
   1. הכנת ויבריו כולרה
      1. החרינו 5 מ"ל מרק ליזוגניה (LB) עם מושבת V. cholerae מבודדת מפלטת LB ודגרו אותה בטמפרטורה של 37°C עם ניעור (180 סל"ד) למשך 6–8 שעות (תרבית לילה).
      2. הסנן 25 מ"ל של מדיום LB אוטוקלאי טרי בתוך בקבוק קוני של 250 מ"ל עם 50 מיקרוליטר מהתרבית הלילית הנ"ל. דגרו אותו במשך 16–18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור (150 סל"ד).
      3. קרא את צפיפות האופט ב-600 ננומטר (OD₆₀₀) של דילול של 1/10 של התרבית הלילית כדי להעריך את מספר החיידקים למילילטר (OD₆₀₀ = 1 הוא ~10⁹ CFU/mL).
      4. קצור את התאים בצנטריפוגה ב-6,000 גרם למשך 10 דקות. הסר את המדיה עם פיפטה או שפוך אותה לתמיסת חיטוי. החזירו את התאים ב-PBS סטרילי לריכוז הרצוי, בדרך כלל בין 1 x^{10 7} ל-1 x^{10 10} למ"ל של PBS.
         הערה: כאן, אנו מתייחסים למים עם אוסמוזה הפוכה עם אוטוקלב המכילים מלחי ים של 60 מ"ג לליטר כמי זיהום סטריליים.
   2. חיסון ודגירה
      1. הניחו ארבעה או חמישה דגי זברה בתוך בקבוק בנפח 400 מ"ל המכיל 200 מ"ל מים סטריליים של זיהומים.
      2. הוסיפו 1 מ"ל של V. cholerae כדי לקבל את ריכוז הזיהום הרצוי (בדרך כלל 5 x^{10 4} עד 5 x^{10 7} CFU/מ"ל) ב-200 מ"ל של מי זיהום.
      3. כסו את הבקבוק במכסה מחורר כדי למנוע מהדגים לקפוץ החוצה; החלק העליון של קופסת טיפ בנפח 200 מיקרוליטר מתאים לכך.
      4. יש לסמן כל בקבוק ולהכניס אותם לאינקובטור עם חזית זכוכית בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך תקופת הניסוי.
   3. הליך לחשיפה חולפת
      הערה: חשיפה חולפת ל-V. cholerae (בדרך כלל 6 שעות) ואחריה הסרת החיידקים המחסנים, שימושית לחקר ההעברה ולכימות מדויק יותר של החיידקים המופרשים.
      1. לאחר 6 שעות של חשיפה, שפכו את מי הכוסית דרך רשת כדי לאסוף את הדגים. להשליך את המים הנגועים למיכל אקונומיקה כדי להרוג את ה-V. cholerae.
      2. הניחו את הדג שהוסר בכוס של 200 מ"ל מים סטריליים לזיהומים. אפשרו לדגים לשחות במים הנקיים האלה במשך 5 דקות כדי להסיר את החיידקים על פני השטח מהדג.
      3. חזור על הליך הרשת והניח את הדג בבקבוק חדש של מים סטריליים של 200 מ"ל. השאר את הדגים בבקבוק הזה לאורך כל תקופת הניסוי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כלי נגינה
חממה	נואייר, פלימות', מינסוטה	זרימה אוטומטית
חומרים
כוסות זכוכית 400 מ"ל	פיירקס
מכסים מחוררים	מחזיק מיקרוטיפ עם חורים מתיבת הטיפ
מערכת אקווריום הדגים	אקוונירינג, סן דייגו, קליפורניה
מטהר מים RO	אקווה אפקס	TK001
רשת דיג	מרינה
מזון לדגים	טטרה פין
פלטת פטרי	פישר ברנד, המפטון, ניו המפשייר	FB0875713
צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל	Midsci, ואלי פארק, מיזורי	AVSS1700
מבחנות בדיקה	פיירקס	9820
מיקרופיפטות	סארטוריוס ביוהיט, גטינגן, גרמניה	M1000/M200/M20
טיפים	ג'נסי סיינטיפיק, סן דייגו, קליפורניה	24-150RS/24-412
LB בינוני
טריפטון	BD ביוסיינס, סן חוזה, קליפורניה	211705
תמצית שמרים	BD ביוסיינס, סן חוזה, קליפורניה	212750
NaCl	פישר סיינטיפיק, המפטון, ניו המפשייר	BP358-212
אגר	BD ביוסיינס, סן חוזה, קליפורניה	214010