הערכת חדירות המעי ב-C. elegans לאחר חשיפה לחיידקים

תקציר

מקור: לה, ט. א. נ., ואחרים, מדידת השפעות חיידקים וכימיקלים על חדירות המעיים של Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת פלואורסצנציה לכמת חדירות המעי ב-C. elegans שנחשפו ל-Pseudomonas aeruginosa. בהשוואה לביקורת שקיבלו Escherichia coli, תולעים שטופלו בפתוגן מראות דליפת פלואורופור מוגברת לחלל הגוף, מה שמעיד על נזק למחסום האפיתליאלי.

פרוטוקול

1. הכנת לוחות גידול נמטודות (NGM) לבדיקת השפעות חיידקים שונים על חדירות המעי של Caenorhabditis elegans (C. elegans)

1. הנח 1.25 גרם פפטון, 1.5 גרם NaCl, 8.5 גרם אגר, מערבל מגנטי ו-487.5 מ"ל מים מזוקקים בבקבוק זכוכית בנפח 500 מ"ל.
2. ערבבו היטב את התערובת, חפרו את התערובת ל-15 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס, וקררו את התערובת ל-55 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 30 דקות.
3. הסר את המדיום מאמבט המים, הוסף את הרכיבים (0.5 מ"ל של 1 M CaCl₂, 0.5 מ"ל כולסטרול, 0.5 מ"ל MgSO₄, 12.5 מ"ל KPO₄) ל-NGM, ומערבב היטב.
   הערה: כל הרכיבים הבודדים חייבים לעבור אוטוקלף למעט הכולסטרול (מומס באתנול מוחלט), וכל שלב ניסיוני חייב להתבצע על ספסל נקי.
4. יש לפזר 20 מ"ל של NGM לכל צלחת פטרי בגודל 90 על 15 מ"מ ולתת לאגר להתייצב על ספסל נקי בטמפרטורת החדר (כ-20 מעלות צלזיוס). לוחות ה-NGM יכולים להיאחסן עד חודש בטמפרטורה של 4°C.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. לוחות ה-NGM ששימשו לצביעת FITC-dextran (פלואורסציין איזותיוציאנט-דקסטרן) הוכנו. 10 מ"ל NGM חולקו לכל צלחת פטרי בגודל 60 על 15 מ"מ והותרו להתקשות על ספסל נקי בטמפרטורת החדר (כ-20 מעלות צלזיוס).
5. הסר את תרבית החיידקים מהמקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומערבל את התרבית היטב לפני שמפזרים את התרבית על לוחות ה-NGM.
6. הוסף סך הכל 800 מיקרוליטר של תרבית החיידקים לכל לוח NGM טרי, ומאפשר לצלחות להתייבש באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
   הערה: לניסוי הראשון (איור 1), הוכנו שתי לוחות NGM עם E. coli OP50, לוח NGM אחד עם P. aeruginosa PAO1, ולוח NGM אחד עם E. faecalis KCTC3206. לניסוי השני (איור 2), הוכנו שתי לוחות NGM עם E. coli חי OP50, צלחת NGM אחת עם P. aeruginosa PAO1 חי, ולוח NGM אחד עם P. aeruginosa PAO1 מושבתת חום.

3. הכנת C. elegans מסונכרנים לגיל

1. גידול תולעים על פלטת NGM מוצקה והאכיל אותן ב-E. coli OP50 עד שמגיעים לאוכלוסייה הרצויה.
2. סנכרן את הביצים באמצעות שיטת הטלת ביצים בזמן או באמצעות טיפול בתמיסת הלבנה

4. טיפול בחיידקים והאכלה ב-FITC-dextran

1. דגרו את הביצים המסונכרנות לגיל בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 64 שעות על צלחות NGM בתוספת E. coli OP50 חיות כמזון.
2. שטפו את זחלי L4 המסונכרנים לגיל עם בופר S והעבירו אותם (יותר מכ-500 תולעים) לצלחות NGM המטופלות המכילות חיידקים וכימיקלים שונים. דגרו אותם בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
   הערה: זמן הטיפול יכול לנוע בין 24 ל-72 שעות, בהתאם לחיידקים ולכימיקלים בהם משתמשים. ההשפעה הטיפולית או המניעתית של DIM יכולה להיבחן גם על ידי טיפול מוקדם בתולעים בפתוגנים ולאחר מכן טיפול בתולעים ב-DIM (האפקט הטיפולי), או על ידי טיפול מוקדם בתולעים ב-DIM ולאחר מכן טיפול בפתוגנים (האפקט המונע).
3. להכנת הצלחות המושלמות ב-FITC-dextran, ערבבו 2 מ"ל של E. coli OP50 מושבת בחום עם 4 מ"ג FITC-dextran. לאחר מכן, חלקו 100 מיקרוליטר מתערובת FITC-dextran ו-E. coli OP50 לעשרים לוחות אגר טריים של NGM (60 מ"מ על 15 מ"מ) ומאפשרים לצלחות להתייבש במשך שעה על ספסל נקי.
   הערה: הריכוז הסופי של FITC-dextran בכל לוח NGM יהיה 20 מיקרוגרם/מ"ל.
4. הכינו חמש לוחיות NGM המכילות E. coli OP50 ללא FITC-dextran לטיפול בקרת הרכב. למטרה זו, חלקו 100 מיקרוליטר E. coli OP50 מושבת חום לכל לוח אגר NGM טרי (60 מ"מ x 15 מ"מ) ואפשרו לפלטות להתייבש במשך שעה על שולחן נקי.
   הערה: לכל ניסוי עצמאי נדרשים חמישה עשר לוחות NGM עם תוספת FITC-dextran וחמש לוחות NGM ללא FITC-dextran.
5. לאחר 48 שעות טיפול (משלב 7.2), שטפו את התולעים עם S-buffer, העבירו את התולעים לצלחות FITC-dextran המושלמות וללוחות NGM ללא FITC-dextran, ודגרו את הלוחות במשך הלילה (14–15 שעות).
   הערה: לכל קבוצת טיפול נדרשים 5 שכפולים של צביעת FITC-dextran (או האכלה בבקרת רכב).
6. שטפו את התולעים עם S buffer ותנו להן לזחול לתוך צלחת האגר הטרייה של NGM למשך שעה.
   הערה: לכל ניסוי עצמאי נדרשים בסך הכול 20 לוחות NGM טריים. בשלב זה ניתן להשתמש בצלחת NGM עם או בלי E. coli OP50.
7. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת פורמלדהיד 4% לכל באר של פלטה שחורה עם תחתית שטוחה עם 96 בארות. העבר כ-50 תולעים מכל לוח NGM לכל באר למדידות פלואורסצנציה. לאחר דקה עד שתיים, הסר היטב את כל הפורמלדהיד מכל באר ומוסיפים 100 מיקרוליטר מדיום התקנה כדי לצפות את הבארות.
   הערה: תמיסת פורמלדהיד (4%) משמשת לקיבוע ותיקון התולעים. לכל קבוצת טיפול, נעשה שימוש ב-5 בארות (5 שכפולים) לניתוח תמונה.

5. הדמיית C. elegans באמצעות מערכת הדימות Operetta וקביעת חדירות המעיים על ידי מדידת קליטת פלואורסצנציה FITC-dextran

הערה: מיקרוסקופיה סטריאוסקופית פלואורסצנטית יכולה לשמש לניתוח תמונות במקום מערכת האופרטה.

1. ללכוד תמונות פלואורסצנציה ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנציה באמצעות מערכת ההדמיה בתוכן גבוה של Operetta ולנתח את התמונות באמצעות תוכנת Harmony.
2. בתוכנת Harmony, לחץ על האייקון Open Lid כדי לפתוח את המכסה ולהכניס את הפלטה למכונה.
3. הגדר את הפרמטרים.
4. לחץ על הגדרה, בחר את סוג הלוח (Corning שטוח-תחתית 96 באר), והוסף את הערוצים (ערוצי שדה בהיר ו-EGFP).
5. כוון את הפריסה. עבור לבחירת הפריסה, ואז בחר Track ומתאים את הפרמטרים (התמונה הראשונה ב-1 מיקרון, מספר המישורים 10, המרחק הוא 1 מיקרון).
6. בחר אחד מבארות הטיפול ושדה לכידת אחד ולחץ על Test כדי לבדוק אם התמונות מספקות בסעיף הניסוי Run .
7. אם התמונות מספקות, חזור לאזור ההגדרה ולחץ על אייקון האיפוס בסוף המסך. לאחר מכן, בחר את כל בארות היעד ומספר מתאים של שדות לכידה.
8. עבור שוב ל-Run Experiment והזן את שם הלוחית, ואז לחץ על Start כדי להתחיל לעבד.
9. כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנציה, גש לחלק ניתוח התמונה והזן את התמונה. מצאו את התא על ידי בחירת ערוץ EGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר) ושיטה B. כווננו את הסף המשותף ל-0.5, את השטח ל->200 מיקרון², את גורם הפיצול ל-3.0, את הסף הבודד ל-0.18, ואת הניגוד ליותר מ-0.18. לאחר מכן, מחשבים את תכונות העוצמה ובחרו את הממוצע כפלט. לחץ על אייקון Apply כדי לשמור את ההגדרה.
10. עבור למדור ההערכה כדי למדוד את העוצמה על ידי קבלת מפת חום וטבלת נתונים. הגדר את פרמטר הקריאה לתאים — עוצמת תא EGFP ממוצע — ממוצע לכל באר והתחל את ההערכה.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
11. כדי לחלץ את הנתונים מ-Operetta, לחץ על כפתור ההגדרה ובחר בניהול נתונים.
12. בחר כתיבת ארכיון, ואז פתח את הגלישה ובחר את הקובץ.
13. כדי לבחור את הקובץ, לחצו על האות הקטן + בפינה השמאלית, ואז לחצו על מדידה ובחרו שם לוחית.
14. בחר את הקובץ ולחץ על אישור.
15. בחר את הנתיב לשמירת הקובץ על ידי לחיצה על אות הגלישה בנתיב הפעיל.
16. לחץ על Start כדי לשמור את קובץ הנתונים.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

תוצאות

איור 1: השפעות חיידקים שונים על חדירות המעי של C. elegans. תמונות מיקרוסקופיות של התולעים כולל תמונות שדה בהיר, פלואורסצנציה של FITC (ערוץ ירוק) ותמונות משולבות. תמונות מיקרוסקופיות של תולעים מ-(A)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות פטרי בקוטר 90×15 מ"מ	SPL מדעי החיים, דרום קוריאה	10090
צלחות פטרי בקוטר 60×15 מ"מ	SPL מדעי החיים, דרום קוריאה	10060
בקטור אגר	בקטון דיקינסון	מקור 214010
תמיסת פורמלדהיד	סיגמא	F1635
עירוי מוח-לב (BHI)	בקטון דיקינסון	מקור 237500
Caenorhabditis elegans N2	מרכז גנטיקה לדלקת קאנורהבדיטיס (CGC)		סוג פראי
פלטת קוסטה אסיי, 96 וול שחור עם תחתית שטוחה שקופה, לא מטופלת, פוליסטירן ללא מכסה	קורנינג אינקורפורייטד	מקור 3631
אשריכיה קולי OP50	מרכז גנטיקה לדלקת קאנורהבדיטיס (CGC)
פלואורסאין איזותיוציאנט - דקסטרן	סיגמא	FD10S
תוכנת הרמוניה	פרקיןאלמר		ורסון 3.5
לוריה-ברטאני LB בינוני	מרק	VM743185 626 1.10285.5000
מגנזיום סולפט הפטהידרט	ביוריאגנטים של פישר	BP2213-1
מדיום התקנה מימי פלואורומאונט	סיגמא	F4680
מערכת ניתוח תוכן גבוה של Operetta CLS	פרקיןאלמר	HH16000000
פפטון	מרק	EMD 1.07213.1000
פסאודומונס אארוגינוסה PA01	אוסף קוריאני לתרבות הטיפוס	KCTC מס' 1637
כלוריד נתרן	ביוריאגנטים של פישר	BP358-1
מיקרוסקופ סטריאו	ניקון, יפן	SMZ800N
תמצית שמרים	בקטון דיקינסון	מקור 212750