$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים המוסדית המקומית וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. הכנת תרביות סלמונלה טיפימוריום ΔAroA לטיפול אוראלי בעכברים
- ממלאי גליצרול קפוא של S. Typhimurium ΔAroA, יש להכין צלחת סטריק באמצעות אגר Luria-Bertani (אגר LB) המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין עם לולאת חיסון סטרילית. דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ניתן לאחסן לוחות רצף עד שבוע בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- יום אחד לפני ההדבקה, יש להכין את האנטיביוטיקה על ידי המסה של 0.5 גרם סטרפטומיצין ב-2.5 מ"ל מים. לאחר סינון תמיסת הסטרפטומיצין, עשו סילוק פה של העכברים באמצעות מחט גאבאז' 22 גרם עם קצה בורה ומזרק 1 מ"ל עם 100 מיקרוליטר תמיסת סטרפטומיצין (20 מ"ג סטרפטומיצין למנה). באמצעות לולאת חיסון, הזרקו 3 מ"ל מרק LB (50 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) בצינור תרבית עם מושבה אחת. לדגור את תרבית הסלמונלה באופן אירובי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה עם ניעור במהירות של 200 סיבובים לדקה (RPM).
- ביום ההדבקה, יש להכין את מנת ההדבקה הסופית על ידי ביצוע 2 דילול רצוף של 1/10 תרביות סלמונלה בלילה במי מלח סטריליים מסוג פוספט בופר (PBS). כתוצאה מכך, חיסון של 100 מיקרוליטר המכיל כ-3 x 106 יחידות יצירת מושבות (CFU).
- באמצעות מחט גאבאז' עם קצה בורה של 22G ומזרק של 1 מ"ל, חטף כל עכבר 100 מיקרו-ליטר של סלמונלה מוכנה.
הערה: הכינו תרביות סלמונלה באמצעות טכניקות אספטיות. ריכוז החיסון הסופי של סלמונלה ניתן לאמת על ידי ציפוי דילול סדרתי על אגר LB עם סטרפטומיצין.
2. הערכת עומסי סלמונלה ברקמות
- הכינו מיקרו-צינורות באורך 2 מ"ל, נעילה בטוחה, עם תחתית עגולה, עם 1 מ"ל PBS סטרילי וחרוז נירוסטה עם אוטוקלב. שקלו מראש את החצוצרות לפני איסוף הרקמות.
- הסרת הרקמות הצריכות והטחול מעכברים שהושמדו בעקבות חשיפה לפחמן דו-חמצני. לאסוף רקמות מבעלי חיים בודדים בצינורות נפרדים. שקלו את הצינורות כדי לקבוע את משקל הרקמות.
- הומוגניזציה באמצעות מכשיר מיקסר ל-15 דקות ב-30 הרץ. העבר 900 מיקרוליטר PBS לכל באר בבלוק 2 מ"ל מגה-ליטר עם 96 בארות. פיפט של 100 מיקרו ליטר רקמה הומוגנציה לבאר הראשונה, מערבבת היטב, ומבצעת דילול סדרתי על ידי הוספת 100 מיקרו-ליטר לבארות הבאות עד להשגת דילול של 10⁻⁶. לוח של 10 מיקרוליטר מכל דילול בשלושה כפילים על אגר LB המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין.
- לספור ולכפל את ממוצע ה-CFU פי 100 מאחר ש-10 מיקרוליטר מהדגימה של 1000 מיקרוליטר צופה, וגורם הדילול המתאים. חלק את משקל הרקמה הכולל של ה-CFU במשקלי הרקמה כדי לקבוע את ה-CFU לגרם רקמה.
הערה: השאירו את כל הדגימות על קרח או בטמפרטורה של 4°C במהלך עיבוד הרקמות. השתמש בקצוות פיפטה רחבי פתח בעת ביצוע דילול סדרתי עם הומוגנטים ברקמה. הכינו מראש את מגה-בלוק עם 96 בארות המכיל PBS.