עיבוד רקמות נגועות לספירת חיידקים במודל זיהום משותף בעכבר

תקציר

מקור: לנהרד, א., ואחרים. מודל עכבר למעבר של Streptococcus pneumoniae ממתיישב לפתוגן בעקבות זיהום נגיפי משחזר מחלה שהוחמרה על ידי הגיל. J. Vis. Exp. (2022)

הסרטון הזה מדגים את עיבוד הריאות של עכבר שנדבק יחד בחיידק פתוגני ובווירוס. טחון, הומוגניזציה וציפוי רקמת הריאה מאפשרים כימות של עומס חיידקים, מה שמעיד על התפשטות חיידקים לריאות וחומרת המחלה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים המוסדית המקומית וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. עיבוד רקמות נגועות לספירת חיידקים

1. איסוף ריאות
   1. באמצעות מספריים חתוכים, חתכו את צידי כלוב הצלעות החשוף ומשכו בעדינות את הצלעות כלפי ראש העכבר כדי לחשוף את הלב. הכנס מחט של 25 גרם המחוברת למזרק של 10 מ"ל מלא מראש במי מלח עם פוספאט (PBS) לחדר הימני והתחל בהפרפוזציה האיטית. חפשו הלבנה של הריאות כאינדיקציה להצלחת הפרפוזיה. שטוף לאט כדי למנוע שבירת רקמת הריאות.
   2. הרימו את הלב עם המלקחיים ובצעו חתך כדי להפריד בין הריאות ללב. לאחר ההפרדה, הרימו את כל האונות של הריאה עם המלקחיים ושוטפים בצלחת עם PBS סטרילי כדי להסיר שאריית דם. בצלחת פטרי, טחנו את הריאות לחתיכות קטנות וערבבו היטב. הסר חצי מתערובת הריאות לקביעת יחידות יצירת מושבות חיידקיות (CFU) או יחידות יצירת פלאק ויראליות (PFU) ומניח אותה בצינור עגול תחתית של 15 מ"ל מלא מראש ב-0.5 מ"ל PBS להומוגניזציה.
      הערה: חשוב לא לקחת אונות שונות של אותה ריאה להערכות השונות. במקום זאת, כל האונות צריכות להיות קצוצות, מעורבבות היטב יחד ומנותקות באופן שווה עבור ההערכות השונות.
2. כדי להומוגן את הרקמה שנאספה, תחילה מנקים את הגשוש ההומוגניזר על ידי הכנסתו ל-70% אתנול והדלקת ההומוגנייזר בעוצמה של 60% למשך 30 שניות. חזור על השלב במים סטריליים במשך 10 שניות. הומוגניזציה של כל רקמה למשך דקה. נקה את גלאי ההומוגנייזר במים סטריליים בין כל דגימה ובצינור טרי עם 70% אתנול בין כל איבר לקבוצת הדגימה.
3. ספירת מספרי חיידקים
   1. לאחר שכל האיברים נאספו והומוגניזציה, דילול סדרתי של לוחות על לוחות אגר דם. כדי לחשב את ה-CFU הכולל, השתמשו ב-10 מיקרוליטר לציפוי ורשמו את הנפח הסופי במילימטר עבור כל דגימה. הדגרה בלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס/5%_CO2.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מזרקים חד-פעמיים BD עם קצות Luer-Lok (1 מ"ל)	פישר	14-823-30
מספריים עדינים לניתוח פישרברנד	פישר	08-951-5	כלים המשמשים לקציר
פישרברנד מנתח מלקחיים רקמיים	פישר	13-812-38	מלקחיים לקציר
מזרקים סטריליים של פישרברנד לשימוש חד-פעמי (10 מ"ל)	פישר	14-955-459