יצירת שכבת קולונואיד אנושית עם פונקציית מחסום לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן

תקציר

מקור: In, J. G. ואחרים. מונולאידים של קולונואידים אנושיים לחקר אינטראקציות בין פתוגנים, קומנסלים ואפיתליום מעי של המארח. J. Vis. Exp. (2019).

הסרטון הזה מדגים את התהליך לגידול תאי אפיתל שמקורם במעי הגס על מערכת טרנסוול מצופה קולגן, ליצירת שכבה מונולקולית שמייצרת ריר שמדמות את מחסום המעי ומאפשרת מחקרי אינטראקציה בין מארח לפתוגן.

פרוטוקול

1. ציפוי האנטרואיד/קולונואיד

1. אם הכנסות מצופות אוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, יש לאזן את האיזון באינקובטור תרבית רקמה CO₂ של 37 מעלות צלזיוס/5% לפחות 30 דקות לפני ציפוי התאים.
2. לכל תוספת לציפוי, יש להכין 1 מ"ל חומר התפשטות חם (בין 25-37 מעלות צלזיוס) ולהוסיף 10 מיקרומום Y-27632 ו-10 מיקרומום CHIR 99021.
   הערה: EM מורכב מ-Advanced DMEM (מדיום הנשר המותאם של Dulbecco) /F12 המכיל B27 (1x), 50% מדיום מותנה WNT3A, 15% מדיום מותנה על ידי RSPO1, 10% מדיום מותאם לנוגין, 50 ng/mL EGF אנושי (Epidermal Growth Factor), 500 ננומטר A-83-01, 10 מיקרומום SB 202190, קוקטייל אנטיביוטיקה/אנטימיקוטי (1x), 10 מ"מ HEPES (N-(2-הידרוקסיאתיל)פיפראזין-N'-(2-אתןסולפונית)), דיפפטיד L-אלניל-L-גלוטמין (1x), ופניצילין-סטרפטומיצין (1x) (ראו טבלת חומרים).
3. שאיבת מדיום השטיפה מהצינור המכיל את כדור התא ותליית מחדש בנפח EM מספיק כדי לספק לפחות 100 מיקרוליטר להכנסה.
4. שאיבו את תמיסת הקולגן IV מכל הכנסה ושטפו פעמיים עם 150 מיקרו ליטר של מדיום הכביסה לכל הכנסה.
5. פיפט 600 מיקרוליטר של EM לחלל שמתחת לכל הכנסה.
6. פיפטה של 100 מיקרוליטר של תליית תא לכל הכנסה.
7. החזירו את הצלחת לאינקובטור תרבית הרקמה והשאירו אותה ללא הפרעה לפחות 12 שעות.
   הערה: הימנעו מניעור או הטיה חדה של הלוח כדי למנוע פיזור לא אחיד של שברי קולונואיד על ממברנת ההכנסה.
8. מנטרים את חיבור התאים והתפשטותם ליצירת שכבה מונו-שכבה מתאחדת על ידי הנחת הלוח על מיקרוסקופ אור קונטרסט פאזה תחת עדשת אובייקטיב 2.5x-10x.
9. לאחר יום-יומיים, רוב השברים אמורים להיצמד למטריצת הקולגן. רעננו את מדיום התרבית והפסיקו את הטיפול עם Y-27632 ו-CHIR 99021. המשיכו לרענן את המדיום כל 2-3 ימים עד שיתאחדו. המפגש בדרך כלל מושג תוך 7-10 ימים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-אמינו-2-(הידרוקסימתיל)-1,3-פרופנדיול	סיגמא	T4661	בסיס טריס, רכיב של בופר הליזיס
A-83-01	טוקריס	2939	מעכב ALK4/5/7
חומצה אצטית, קרחוניות	פישר סיינטיפיק	A38
DMEM/F12 מתקדם	טכנולוגיות חיים	12634-010	רכיב מדיום הצמיחה
קוקטייל אנטיביוטיקה/אנטימיקוטי	אינויווגן	אנט-PM-2	פרימוסין (100x)
B27, 50x	טכנולוגיות חיים	17504-044	רכיב מדיום הצמיחה
תוספות תרבית תאים	קורנינג	3470	טרנסוול, ממברנת PET, נקבוב 0.4 מיקרון, פלטת 24 בארות
CHIR 99021	טוקריס	4423	מעכב GSK3β
קולגן IV, מהשליה האנושית	סיגמא	C5533
תמיסת קצירת אורגנואידים של Cultrex	טרביגן	3700-100-01	מפרק פולימריזציה של מטריצת ממברנת הבסיס
אתנול, אבסולוטי	פארמקו	111000200
GlutaMAX	טכנולוגיות חיים	35050-061	דיפפטיד L-אלניל-L-גלוטמין, 200 מ"מ
קו תאים HEK293T/Noggin-Fc	מעבדת ואן דן ברינק, מכון טייטגט לחקר כבד ומעיים		לייצור מדיום מותאם לנוגין
קו תאים HEK293T/RSPO1-Fc-HA	טרביגן	3710-001-K	לייצור מדיום מותאם Rspondin-1
HEPES, 1 M	טכנולוגיות חיים	15630-080	רכיב מדיום הצמיחה
גורם גדילה אפידרמלי אנושי (EGF)	מערכות מחקר ופיתוח	236-EG-01M	רכיב מדיום הצמיחה
מיקרוסקופ אור לתרבות תאים הפוכה	אולימפוס	CKX51
קו תאים L-WNT3A	ATCC	CRL-2647	לייצור מדיום מותאם ל-Wnt3a
מטריג'ל, גורם גדילה מופחת	קורנינג	356231	מטריצת ממברנת בסיס לתרבות תלת-ממדית
מגרד מיני-תאים	יונייטד ביוסיסטמס	MCS-200
נוגדן MUC2, מונוקלונלי לעכבר	אבקאם	ab11197	משתמשים ב-1:100 לצביעת חיסונים, 1:500 לאימונובלוטינג
חלקיקי לנטיויראל של MUC2 shRNA	GE Dharmacon	RHS4531	shRNA לנטיויראלי GIPZ, מזהה: 4583
מתנער מסלולי	גרנט אינסטרומנטס	PSU-10i
פניצילין-סטרפטומיצין, 100x	טכנולוגיות חיים	15140-122	רכיב מדיום הצמיחה
סוניקטור עם מיקרו-טיפ	ברנסון אולטרסוניקס	450
קוקטייל מעכבי פרוטאז לתאים יונקים	סיגמא	P8340	רכיב בבופר הליזה
SB 202190	טוקריס	1264	מעכב MAPK p38
כלוריד נתרן	סיגמא	S3014	רכיב בבופר הליזה
נתרן דקסויכולאט	סיגמא	D6750	רכיב בבופר הליזה
נתרן דודציל סולפט	סיגמא	L3771	רכיב בבופר הליזה
TrypLE Express, 1x	טכנולוגיות חיים	12605-010	טריפסין, לעיכול שברי אנטרואידים/קולונואידים
נוגדן וינקולין, מונוקלונל ארנב	אבקאם	ab129002	שימוש ב-1:1000 לאימונובלוטינג
מים, דרגת תרבית רקמה, מסונן סטרילי	קורנינג	25-055
Y-27632	טוקריס	1254	מעכב RhoA/ROCK