יצירת ספרופלסטים מחיידקים גרם-שליליים

תקציר

מקור: פיגוארואה, ד. ואחרים. ייצור והמחשה של ספרופלסטים ופרוטופלסטים חיידקיים לאפיון מיקום פפטידים אנטימיקרוביאליים. J. Vis. Exp. (2018).

הסרטון הזה מדגים את הכנת ספרופלסטים מחיידקים בצורת מוט ושליליים גרם. חיידקים גדלים בנוכחות אנטיביוטיקה ליצירת סיבים מוארכים. אלה נשטפים בתמיסה היפרטונית ומטופלים באמצעות בופר ליזיס להסרת דופן התא החיצונית. טיפול היפוטוני יוצר ספרופלסטים, שמיוצבים באמצעות תמיסה איזוטונית מקוררת ומאוחסנים בתנאים קרים.

פרוטוקול

1. הכנת תמיסה

הערה: הכינו תמיסות המתוארות בשלבים 1.1–1.9 כדי לייצר ספרופלסטים של Escherichia coli (E. coli)

1. הכינו 1 מטר טריס(הידרוקסימתיל)אמינומתאן הידרוכלוריד (Tris-Cl), pH 7.8 על ידי המסה של 10.34 גרם טריס·HCl ו-4.17 גרם טריס(הידרוקסימתיל)אמינומתאן (Tris·OH) ב-50 מ"ל מים מזוקקים (dH₂O) בבקבוק של 125 מ"ל. סטריליזציה על ידי סינון דרך מסנן מזרק בקוטר 25 מ"מ עם ממברנה של 0.2 מיקרון ואחסנו בצינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
2. הכינו תמיסה A (20 mM מגנזיום כלוריד (MgCl₂), 0.7 מיליון סוכרוז, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) על ידי המסה של 0.10 גרם MgCl₂ (95.2 גרם למול) ו-11.98 גרם סוכרוז (342.3 גרם למול) ב-25 מ"ל dH₂O בבקבוק של 125 מ"ל. הוסף 500 מיקרוליטר 1 מטר Tris-Cl (pH 7.8) וכיוון את הנפח ל-50 מ"ל. סטריליזציה על ידי סינון דרך מסנן מזרק בקוטר 25 מ"מ עם ממברנה של 0.2 מיקרון ואחסנו בצינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
3. הכינו תמיסה B (10 mM MgCl₂, 0.8 M סוכרוז, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) על ידי המסה של 0.05 גרם MgCl₂ (95.2 גרם למול) ו-13.69 גרם סוכרוז (342.3 גרם למול) ב-25 מ"ל dH₂o בבקבוק של 125 מ"ל. הוסף 500 מיקרוליטר 1 מטר Tris-Cl (pH 7.8) וכיוון את הנפח ל-50 מ"ל. סטריליזציה על ידי סינון דרך מסנן מזרק בקוטר 25 מ"מ עם ממברנה של 0.2 מיקרון ואחסנו בצינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
4. הכינו 0.8 מטר סוכרוז על ידי המסה של 13.69 גרם סוכרוז (342.3 גרם למול) ב-50 מ"ל dH₂o בבקבוק של 125 מ"ל. סטריליזציה על ידי סינון דרך מסנן מזרק בקוטר 25 מ"מ עם ממברנה של 0.2 מיקרון ואחסנו בצינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
5. הכינו 5 מ"ג/מ"ל דאוקסיריבונוקלאז I (DNase I) על ידי המסה של 0.015 גרם DNase I ב-3 מ"ל dH₂o בבקבוק של 50 מ"ל. סטריליזציה על ידי סינון דרך מסנן מזרק בקוטר 25 מ"מ עם ממברנה של 0.2 מיקרון. תמיסה של Aliquot לתוך צינורות מיקרופוג' ומאוחסנת בטמפרטורה של −20°C.
6. הכינו 0.125 מ' אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA), pH 8.0, על ידי המסה של 0.698 גרם די-נתרן דיהידראט EDTA (372.2 גרם למול) ל-15 מ"ל dH₂o בבקבוק של 125 מ"ל. סטריליזציה על ידי סינון דרך מסנן מזרק בקוטר 25 מ"מ עם ממברנה של 0.2 מיקרון ואחסנו בצינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
7. הכינו 600 מיקרוגרם/מ"ל צפלקסין על ידי המסה של 0.03 גרם צפלקסין הידראט (365.404 גרם למול) ב-50 מ"ל dH₂o בבקבוק של 125 מ"ל. סטריליזציה על ידי סינון דרך מסנן מזרק בקוטר 25 מ"מ עם ממברנה של 0.2 מיקרון ואחסנו בצינור חרוטי בטמפרטורה של 4°C.
8. הכינו 5 מ"ג/מ"ל ליזוזים על ידי המסה של 0.015 גרם ליזוזים ב-3 מ"ל dH₂O בבקבוק של 50 מ"ל. סטריליזציה על ידי סינון דרך מסנן מזרק בקוטר 25 מ"מ עם ממברנה של 0.2 מיקרון. תמיסה של Aliquot לתוך צינורות מיקרופוג' ומאוחסנת בטמפרטורה של −20°C.
9. הכינו 3% ללא ציר סויה טריפטיקאז (TSB) על ידי המסה של 30 גרם TSB ב-1 ליטר dH₂O בבקבוק של 2 ליטר. אליקוט את התמיסה לבקבוקים המכילים 25 מ"ל או 100 מ"ל TSB לשימוש בהכנת פרופלסטים של E. coli או פרוטופלסטים של B. megaterium, בהתאמה. בקבוקי אוטוקלב לחיטוי החומר הנוזלי. TSB סטרילי ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר או ב-4 מעלות צלזיוס.
10. הכינו את התמיסה C (1 מיליון סוכרוז, 0.04 מיליון מליאט, 0.04 M MgCl₂, pH 6.5) על ידי המסה של 34.23 גרם סוכרוז (342.3 גרם למול), 0.46 גרם חומצה מאלית (116.07 גרם למול), ו-0.38 גרם MgCl₂ (95.21 גרם למול) ב-100 מ"ל dH₂o בבקבוק של 250 מ"ל. כוון את ה-pH ל-6.5. סטריליזציה על ידי סינון דרך מסנן מזרק בקוטר 25 מ"מ עם ממברנה של 0.2 מיקרון ואחסנו בצינור חרוטי בטמפרטורת החדר.

2. הכנה לתרבות לילה

הערה: בצע את החלקים 2-3 בטכניקות סטריליות מתאימות. אם רוצים, זן חיידקי יכול להכיל פלסמיד לעמידות לאנטיביוטיקה ולהפחית את הזיהום האפשרי. אם משתמשים בזן עם עמידות לאנטיביוטיקה, הוסף את האנטיביוטיקה הנדרשת בשלבים 2.1 ו-3.1–3.2.

1. הכינו תרבית לילה על ידי איסוף מושבה אחת של חיידקים באמצעות קצה פיפטה סטרילית והנחתה בצינור תרבית בנפח 14 מ"ל המכיל 2–3 מ"ל של 3% עם TSB. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, תוך ניעור במשך 16–21 שעות.

3. הכנת ספרופלסטים של E. coli גרם-שלילי

1. בבקבוק של 250 מ"ל, יש לדלל את התרבית הלילית ב-1:100 בנפח של 25 מ"ל של 3% w/v TSB ולדגור את תמיסת החיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, תוך ניעור של כ-2.5 שעות עד שהתמיסה מגיעה לצפיפות אופטית של 0.5–0.8 ב-600 ננומטר. מדדו את הצפיפות האופטית באמצעות ספקטרופוטומטר.
2. בבקבוק של 250 מ"ל, יש לדלל תרבית זו ביחס 1:10 ל-30 מ"ל של 3% w/v TSB ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, תוך ניעור במשך 2.5 שעות בנוכחות 60 מיקרוגרם/מ"ל צפלקסין (347.4 גרם למול) כדי לייצר סיבים חד-תאיים באורך של כ-50–150 מיקרון, שניתן לצפות בהם בהגדלה של פי 1,000 באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 1B).
3. קצור את הסיבים על ידי צנטריפוגה של תמיסת החיידקים בעוצמה של 1,500 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. נקנק והשליך את הסופרנטנט, ושמור את הכדור.
4. שטפו את הסיבים על ידי הוספת עדינות של 1 מ״ל סוכרוז 0.8 מ׳, תוך זהירות לא להפריע לכדור. דגרו דקה אחת, ואז זרקו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
5. הוסף 150 מיקרוליטר של 1 מטר טריס-קל (pH 7.8), 120 מיקרוליטר של 5 מ"ג/מ"ל ליזוזים, 30 מיקרוליטר של 5 מ"ג/מ"ל DNase I, ו-120 מיקרוליטר של 0.125 מ' EDTA בסדר המתאים לכדור ודגור את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
6. הוסיפו 1 מ"ל של תמיסה A בהדרגה במשך דקה אחת לתמיסה שהוכנה ב-3.5 תוך שימוש במיקרופיפטה תוך סיבוב עדין של התמיסה ביד. דגרו את התמיסה במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
7. שים 7 מ"ל של תמיסה B בטמפרטורה של 4°C לשני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל. הוסיפו כמויות שוות של התמיסה שהוכנה ב-3.6 לכל אחת משתי הצינורות הללו. צנטריפוגה את התמיסה בטמפרטורה של 1,500 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
8. באמצעות פיפטה סרולוגית, הסר בזהירות את כל הסופרנטנט פרט ל-1-2 מ"ל מבלי להפריע לכדור. תליית את הכדור על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה באמצעות מיקרופיפט P1000. בדקו ויזואלית את היווצרות הספרופלסטים על ידי צפייה בדגימה בהגדלה של פי 1,000 באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 1C).
9. אחסן את הספרופלסטים בטמפרטורה של מינוס 20°C עד שבוע או עד שיעברו 3 מחזורי הקפאה-הפשרה.

תוצאות

איור 1: תמונות מייצגות של חיידקי Escherichia coli. (A) חיידקי E. coli , (B) נחש E. coli , ו-(C) E. coli spheroplast. התמונות צולמו בהגדלה של פי 100.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
טריזמה הידרוקלוריד (Tris HCl)	סיגמא	T3253
בסיס טריזמה (טריס, אוהיו)	סיגמא	T1503
כלוריד מגנזיום	סיגמא	M8266
סוקרוזה	סיגמא	S7903
ליזוזים	סיגמא	L6876
דאוקסיריבנוקלאז I	סיגמא	D4527
אתילנדיאמין טטראצטית	סיגמא	106361	השתמשתי ב-Sigma 106361 בפיתוח הפרוטוקול המקורי; 106361 הופסק עם ED2SS כתחליף
צפלקסין הידראט	סיגמא	C4895
ציר סויה BBL טריפטיקאז	פישר סיינטיפיק	B11768
חומצה מאלית	סיגמא	M0375
מסנן מזרק Acrodisc 25 מ"מ עם ממברנת Tuffryn HT של 0.2 מיקרון	תאגיד פאל	4192