הקמת מודל עכבר לזיהום סטרפטוקוקוס בקבוצה B בנרתיק

תקציר

מקור: פטרס, ק. א., דוראן, ק. ס. מודל עכבר של קולוניזציה נרתיקית של סטרפטוקוקוס בקבוצה B. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון הזה מדגים את ההכנה והחיסון הנרתיק של עכבר נקבה שטופלה הורמונלית עם סטרפטוקוקוס מקבוצה B כדי למודל זיהום. הוא מסביר כיצד לגדל ולהכין את החיידק, להזריק את החיסון ללומן הנרתיק, ולהבטיח זיהום מוצלח.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים המוסדית המקומית וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. חיסון וגינלי עם סטרפטוקוקוס קבוצה B (GBS)

1. יום אחד לפני החיסון, גדלו תרבית נוזלית של 5 מ"ל של זן GBS מעניין, כמו A909 (סרוטיפ Ia), במרק טוד היואיט (THB) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
2. תת-תרבית של ה-GBS בלילה בנפח 1:10 לתוך THB טרי ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס. הגדלת החיידקים לשלב בלוגריתם (OD₆₀₀ = 0.4-0.5).

הערה: בדרך כלל זה ייקח 2-3 שעות, תלוי בזן של GBS.

3. העבר את תת-התרבית לחיידק צינור קוני סטרילי של 15 מ"ל ב-3,000 × גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט. החזירו את הכדור החיידקי ל-200 מיקרוליטר של מלח סטרילי עם בופר פוספט (PBS).
4. באמצעות הכדור התלוי מחדש, הביאו 3 - 5 מ"ל PBS (1 מ"ל ל-10 עכברים) בדיוק ל-OD₆₀₀ = 0.4 בצינור תרבית חדש בנפח 5 מ"ל. זה יהיה ריכוז של ~ 1 × 10⁸ יחידות יוצרות מושבות (CFU)/ml. העבר לצינור קונוסי חדש של 15 מ"ל ודלף מחדש את החיידקים ב-3,000 × גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט.
5. תשעה את הכדור ב-PBS ב-1/10 מהנפח המקורי. לדוגמה, אם 3 מ"ל של OD₆₀₀ = 0.4 נגררו, יש להחזיר אותו ל-300 מיקרוליטר של PBS.

הערה: זהו ההשעיה החיידקית הסופית (~ 1 × 10⁹ CFU/ml) המשמשת לחיסון בעלי חיים.

6. שמור 50 מיקרולטר מתלייה זו לדילול סדרתי וציפוי על אגר THB כדי לקבוע את האינקולום המדויק.
7. החסן כל עכבר ב-10 מיקרוליטר מהמתלה החיידקי הסופי כך שלכל עכבר יינתן 1 ×^{10 7} CFU.
   1. כדי לחסנ, יש לרסן את העכבר ידנית על ידי אבטחת העור הרפוי בקצה הצוואר בין האגודל לאצבע המורה של המטפל, ואז שיבוט הזנב.
   2. משוך 10 מיקרוליטר של ה-GBS לקצה פיפטה טעינת ג'ל בנפח 200 מיקרוליטר. הכנס את הקצה 5 עד 10 מ"מ לתוך הלומן הנרתיק ומשחרר את 10 מיקרול החיסון.
      הערה: קצות טעינת ג'ל מועדפים על פני קצות סטנדרטיים של 200 מיקרוליטר כדי למזער את הסיכון לטראומה או פציעה באיברים, במיוחד בעכברים צעירים או קטנים.
   3. מיד לאחר החיסון, שחררו את עורף הצוואר והרימו את הקצה האחורי של העכבר, מרימים את העכבר בזנב והולכים עם כפות הרגליים הקדמיות על משטח קשה למשך ~ דקה אחת.
   4. בדקו ויזואלית את פתח הנרתיק לאיתור זרימה חזרה של החיסון. אם נצפית זרימה חוזרת, ניתן להשתמש בקצה פיפטה טרי למניפולציה או להגדלת פתח הנרתיק, ולהקל על קליטת הזרימה החוזרת אל הלומן. בנוסף, ניתן לשאוב את הזרימה באמצעות פיפטה ולחסן מחדש.
      הערה: אם מחלקים חומרים מקומיים, אורגניזמים פרוביוטיים או חלבונים מעניינים, ניתן לתת נפח של עד 20 מיקרוליטר בבופר פיזיולוגי במערכת הנרתיק.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קצות פיפטה לטעינה של ג'ל בנפח 200 מיקרול	USA Scientific	1252-0610
ציר טוד יואיט	הארדי דיאגנוסטיקה	7161C
תמיסת מלח מפופר-פוספט של דולבקו פעם אחת	קורנינג	21-031-CV