כימות דיכוי ביופילם המושר על ידי אנזימים בחיידקים פתוגניים

תקציר

מקור: טיי, ס. ב. ואחרים. הפרעה אנטי-וירולנטית של ביופילמים פתוגניים באמצעות לקטונאזות מהונדסות לכיבוי קוורום. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון מדגים שיטה לכימות ביומסה ביופילמית בחיידק פתוגני, תוך השוואת מערכות ביקורת לא מטופלות לדגימות שטופלו באנזים שמדביר קווארום. האנזים משבש את איתות החיידקים במהלך הדגירה המוקדמת, ומפחית את ההיצמדות של התא. לאחר שטיפה והמשך דגירות, בארות הבקרה יוצרות ביופילמים צפופים, בעוד שבארות מטופלות מראות היווצרות מופחתת. צבע קטיוני משמש לצביעת הביופילם, ונמדד ספיגה להערכת הביומאסה.

פרוטוקול

1. כימות קריסטל סגול של היווצרות ביופילם ב-A. baumannii S1

1. גדלו תרבית של 5 מ"ל של Acinetobacter baumannii S1(A. baumannii) במרק ליזוגני (LB) (טריפטון 10 גרם/ליטר, תמצית שמרים 5 גרם/ליטר) בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס בתנור ניעור (220 סל"ד) למשך 16 שעות.
2. כוונן את התרבית של A. baumannii S1 לצפיפות אופטית רצויה ב-600 ננומטר (OD₆₀₀) של 0.8. באמצעות פלטה עם 96 בארות, החריקו את תרבית החיידקים (דילול של 1:100) ל-LB טרי המכיל 10 מיקרוליטר של אנזים GKL מטוהר (40 מ"ג/מ"ל); הכרך הסופי של התרבות החדשה הוא 100 מיקרוליטר.
3. הכינו גם תרבות בקרה; זה לא יכיל שום אנזים. חזור על תנאים דומים כדי לקבל את מספר השכפולים הרצוי.
4. כסו את הצלחת במכסה והכניסו אותה למיכל פלסטיק אטום בנפח 10 ליטר. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות לפני הסרת המדיה בעדינות.
5. הוסיפו עוד 100 מיקרוליטר מדיום טרי של LB לבאר ודגרו את הצלחת במשך 21 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
6. לאחר התקופה השנייה של הדגירה, הסר בעדינות את כל המדיה. שטוף את תא החיידקים הפלנקטוניים במים סטריליים של 200 מיקרוליטר. ודא שיש הפרעה מינימלית לתאים במהלך הכביסה.
7. הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת סיגלית קריסטלית 1% לכל באר ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את תמיסת הסגול הקריסטלי על ידי שטיפת הבאר במים סטריליים של 200 מיקרוליטר. חזור על הכביסה עוד פעמיים.
8. הוסיפו 100 מיקרוליטר של חומצה אצטית 33% לכל באר ודגרו במשך 15 דקות בניעור עדין; זה ימס את הצבע.
9. כמת את כמות הביופילם שנוצר על ידי מדידת הספיגה של סגול קריסטלי ב-600 ננומטר. כמות הסגול הקריסטלי פרופורציונלית לכמות הביופילם שנוצרת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
טריפטון	BD	211705
תמצית שמרים	BD	212750
לוח 96 בארות	קוסטאר	3596
קריסטל ויולט	סיגמא-אלדריץ'	C6158
חומצה אצטית	סריקת מעבדה	PLA00654X	אזהרה: דליק
קורא מיקרופלט Synergy HT	ביו-טק