הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
312 צפיות
⸱
26 בפברואר 2026
מקור: טיי, ס. ב., et.al. הפרעה אנטי-וירולנטית של ביופילמים פתוגניים באמצעות לקטונאזות מהונדסות לכיבוי קוורום. J. Vis. Exp. (2016)
הסרטון הזה מדגים את תהליך עיכוב היווצרות ביופילם על ידי הכנסת אנזים שמפריע לאיתות תאי חיידקים. האנזים מונע מהחיידקים לייצר חומרים פולימריים חוץ-תאיים, ובכך מפחית את התפתחות הביופילם על מיקרודיסה עם תחתית זכוכית. לבסוף, מבנה הביופילם מוצג באמצעות לקטין פלואורסצנטי ומיקרוסקופ סורקת לייזר קונפוקלי.
1. מיקרוסקופיית סורקת בלייזר קונפוקלי של ביופילם A. baumannii S1
1. לגדל תרבית של 5 מ"ל של A. baumannii S1 במשקל LB בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס בתנור ניעור (220 סל"ד) למשך 16 שעות.
2. להתאים את תרבית A. baumannii S1 ל-OD600 הרצוי של 0.8. באמצעות μ-Dish עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ, החריקו את תרבית החיידקים (דילול של 1:100) ל-LB טרי המכיל 30 מיקרוליטר של אנזים GKL מטוהר (40 מ"ג/מ"ל); הכרך הסופי של The New Culture הוא 1 מ"ל.
3. כסו את צלחת ה-μ במכסה והניחו אותה במיכל פלסטיק אטום בנפח 10 ליטר. דגור את צלחת ה-μ בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות לפני הסרת המדיה בעדינות. הוסיפו 30 מיקרוליטר של אנזים GKL מטוהר ומדיום טרי, ומביאים את הנפח הכולל ל-1 מ"ל. דגרו עוד 21 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
4. חזור על שלב 1.3 ודגר את צלחת ה-μ לעוד 24 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את המדיה בעדינות.
5. הוסף 500 מיקרוליטר של אגלוטינין חיטה (WGA) של Alex Fluo 488-conjugated בנבט חיטה (WGA) מומס בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) לצלחת ודגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; זה יצבע את הביופילם שנוצר. הסר את תמיסת הכתמים ושוטף את μ-Dish ב-2 מ"ל HBSS. חזור על שלב הכביסה עוד פעם אחת.
6. להוסיף 500 מיקרוליטר של 3.7% פורמלדהיד מומס ב-HBSS ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות; זה יקבע את הביופילם על צלחת ה-μ. שטפו את ה-μDish פעם אחת עם 2 מ"ל HBSS ואז הסרו את התמיסה לגמרי. הצלחת μ המקובעת בביופילם יכולה להיאחסן בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני הדמיית CLSM.
7. להדמיה וניתוח CLSM, השתמשו בהגדלה של פי 63 ליצירת 97 ערימות לכל תמונה עם מרווח של 0.21 מיקרון לכל מחסנית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| טריפטון | BD | 211705 | |
| תמצית שמרים | BD | 212750 | |
| לוח 96 בארות | קוסטאר | 3596 | |
| חומצה אצטית | סריקת מעבדה | PLA00654X | אזהרה: דליק |
| μ-צלחת | איבידי | 80136 | |
| אלכס פלואו WGA 488-conjugated | Invitrogen | W11261 | |
| תמיסת המלח המאוזנת של האנק | Invitrogen | 141475095 | |
| פורמלדהיד | סיגמא-אלדריץ' | F8775 | אזהרה: קורוזיבי |
| קורא מיקרופלט Synergy HT | ביו-טק | ||
| מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך 1X-81 | אולימפוס |
