זיהוי סכריבקטריה בתרבות בינארית באמצעות תגובת שרשרת פולימראז

תקציר

מקור: קולינס, א. ג'. ואחרים, הקמת תרביות בינאריות יציבות של סקאריבקטריה סימביוטית מחלל הפה. J. Vis. Exp. (2021)

הסרטון הזה מדגים את השימוש בתגובת שרשרת פולימראז (PCR) לזיהוי סכריבקטריה בתרבית בינארית עם Actinomyces. הפרוטוקול מפרט הגברת DNA ואלקטרופורזה ג'ל לאישור אינטראקציה יציבה בין מארח לטפיל.

פרוטוקול

1. אישור זיהום סקאריבקטרי באמצעות PCR
   1. לאחר 5 מעברים, יש לאשר זיהום בתגובת שרשרת הפולימראז (PCR). חמישה מעברים יבטיחו שכל תאי סקריבקטריה שאינם גדלים ידלדלו מעבר למגבלת הגילוי באמצעות 25 מחזורי PCR.
   2. הכינו מיקס PCR מאסטר. מתכון מומלץ הוא כדלקמן: לכל שפופרת נדרשת, יש להכין 12.5 מיקרוליטר 2x PCR buffer, פריימר קדמי 0.75 מיקרוליטר 10 מיקרומום (580F¹² - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), פריימר הפוך 0.75 מיקרוליטר 10 מיקרומום (1177R¹³- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC), 1 מיקרוליטר 25 מ"מ MgCl_{2, ו-9} מיקרוליטר מים. ערבב על ידי מערבב.
   3. Aliquot 24 מיקרוליטר של מיקס מאסטר לצינור PCR של 0.2 מ"ל. הוסיפו 1 מיקרול תרבית נגועה בסכריבקטריה לתגובת ה-PCR. הניחו את הצינור בתרמחזור ובצעו את הפרוטוקול הבא: דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואז החזקה סופית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   4. טען והריץ את מוצרי ה-PCR בג'ל אגרוז 1%. רצועה של ~600 בסיסים תצביע על נוכחות סכריבקטריה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגרוז	פישר סיינטיפיק	BP160-100
מרק עירוי Brain Heart (אבקה מיובשת)	בקטון-דיקינסון	211059	או מדיום גדילה אחר המתאים לאורגניזמים המטרה
ספק כוח לאלקטרופורזה	ביו-ראד	1645052
מערכת אלקטרופורזה	ביו-ראד	1704467
GoTaq Green Mastermix	פרומגה	M7122
מאסטרסייקלר פרו תרמוסיקלר	אפנדורף	950040025	או תרמחזור מקביל ל-PCR
תמיסת MgCl₂ 25mM	פרומגה	A3513
מים ברמת ביולוגיה מולקולרית	פישר סיינטיפיק	BP2819100
מיקרופיפטה P-1000	גילסון	F123601G
צינורות PCR 0.2 מ"ל	פישר סיינטיפיק	14-230-205
קצות פיפטה - 1000 מיקרוליטר	פישר סיינטיפיק	02-717-166
צביעת ג'ל SYBR Safe DNA	תרמופישר סיינטיפיק	S33102
מרק סויה טריפטי (אבקה מיובשת)	בקטון-דיקינסון	211825	או מדיום גדילה אחר המתאים לאורגניזמים המטרה