$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
הערה: במהלך כל הניסוי, תאי המקרופאגים מודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור אוויר מאולץ של 5%CO2 ומוציאים מהאינקובטור רק למניפולציות ניסיוניות, המתבצעות בארון בטיחות ביולוגי מסוג Class II. העבודה עם חיידקי ליסטריה מונוציטוגנס עומדת לפי תקנות בטיחות ביולוגית רמה 2.
1. הכנת תאים וזיהום חיידקי (ימים 1 ו-2)
- יום 1
- זרעים 2.0 x 10 7 תאי מקרופאג שמקורם במחעצם (BMDM) על צלחת 145 מ"מ במדיה BMDM + Pen-Strep של 30 מ"ל (טבלה 2). זרע 3 צלחות לכל זן חיידקי לניתוח. הדגרה בלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור אוויר כפוי עם 5%CO2 .
- התחל תרבית חיידקים לילית של זן L. monocytogenes מסוג פראי (WT) 10403S ב-10 מ"ל של מדיום הזרקת לב במוח (BHI), בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס במדגם סטנדרטי. הניחו צינורות תרבית מוטים בלי לרעוד.
הערה: תנאי הגדילה הללו מחזקים את הביטוי של גני השוקים, מה שמקדם זיהום יעיל.
- יום 2
- BMDM מדיום לפני חימום (ללא אנטיביוטיקה ל-Pen-Strep) (טבלה 2) ומלח עם בופר פוספט (PBS) ב-37 מעלות צלזיוס.
- שטפו את שכבת המקרופאג פעמיים עם 25 מ"ל PBS מחוממים מראש כדי להסיר אנטיביוטיקה. הוסיפו 30 מ"ל BMDM טרי בינוני.
- שטוף 1.5 מ"ל תרבית חיידקים ללילה עם PBS על ידי צנטריפוגה של חיידקים ב-> 14,000 x גרם למשך דקה, השלכת הסופרנטנט, והשעה עדינה של חיידקים ב-1.5 מ"ל PBS באמצעות פיפטינג. חזור פעמיים.
- הדביקו כל לוח מקרופאג' ב-0.5 מ"ל של תרבית לילה של L. monocytogenes מסוג פראי. אם משתמשים בכמה צלחות, הדביקו כל צלחת בהפרש של 15 דקות. מרווח זמן זה יאפשר לקצור כל צלחת בנפרד בסיום ההדבקה.
הערה: ריבוי ההדבקה (MOI) נבדק על ידי ציפוי דילול סדרתי של תרבית חיידקים המשמשים לזיהום על לוחות אגר BHI וספירת יחידות יצירת מושבות (CFU) לאחר דגירה של 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שימוש ב-0.5 מ"ל של זן 10403S של WT L. monocytogenes מביא ל-MOI ~ 100 (100 CFU חיידקים לכל תא מקרופאג'). בעת ניתוח מוטנטים חיידקיים הפגומים בצמיחה תוך-תאית, יש לקחת בחשבון MOI גבוה יותר. - לאחר דגירה של 0.5 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, שטפו את התאים הנגועים פעמיים עם PBS להסרת חיידקים לא מחוברים, והוסיפו 30 מ"ל מדיום BMDM מחומם מראש. חיידקים מחוברים ייספגו פנימה במהלך 0.5 השעה הקרובה.
- בשעה לאחר ההדבקה, הוסף 30 מיקרוליטר גנטמצין (1:1,000 לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/מ"ל) כדי להרוג חיידקים חוץ-תאיים.
- הרכיבו את מכשיר המסנן על ידי הצבת ראש מסנן על בקבוק איסוף נוזלים עם יציאת ואקום. לאחר מכן מניחים פילטר (0.45 מיקרון) על ראש מסנן, אחריו משפך צילינדר, ומאבטחים את החלקים השונים עם מהדק מתכתי. הכינו מים קרים ללא RNase.
- 6 שעות לאחר ההדבקה, יש לאסוף חיידקים מתאים נגועים כך. טפלו בכל צלחת בנפרד.
הערה: בדרך כלל, L. monocytogenes משלים 1-לוג גדילה במהלך 6 שעות של זיהום בתאי המאקרופאג'. דגירות ארוכות יותר עלולות לגרום לצמיחת יתר חיידקים ולמוות תאי של המאקרופאגים, בעוד שתקופות דגירה קצרות יותר עלולות לגרום לעומס חיידקים נמוך בהרבה. ה-MOI וזמן ההדבקה יכולים להשתנות כדי להגיע לתנאים מיטביים.- שטוף תאים נגועים עם PBS פעם אחת. הוסיפו 20 מ"ל מים קרים ללא RNase כדי לעבור תאי מקרופאג'. באמצעות מגרד תאים, גרדו את התאים מהצלחת במהירות אך בזהירות.
- אסוף תאים מפורקים לצינור קוני של 50 מ"ל. מערבולת ל-30 שניות. צנטריפוגה ב-800 x g למשך 3 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- העבירו את הסופרנטנט דרך מערכת הסינון באמצעות מערכת ואקום. בעזרת פינצטה, גלגלו את המסנן והעבירו במהירות לצינור קוני של 15 מ"ל. הקפיאו את הצינורות עם המסננים בחנקן נוזלי.
- הרכיבו את מכשיר הסינון עם פילטר חדש לדגימה הבאה, כפי שמתואר ב-1.2.7.
- אחסן את המסננים הקפואים בטמפרטורה של מינוס 80°C ליום הבא. לחלופין, יש להמשיך ישירות להפקת חומצות גרעין.
טבלה 1: פרוטוקול תגובת DNase.
| RNA | עד 2 מיקרוגרם (בנפח מקסימלי של 44 מיקרוליטר) |
| 10x DNase buffer | 5 מיקרוליטר |
| מים ללא RNase | שלם עד 50 מיקרוליטר בנפח כולל |
| DNAse | 1 מיקרוליטר (1 יחידה) |
טבלה 2: מתכונים למדיה ובופרים.
| 1. 500 מ"ל BMDM+מדיום עט-סטרפטוק (מסנן מחטא): | |
| ה-Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco | 235 מ"ל |
| סרום בקר עוברי (FBS) (מושבתת 30 דקות ב-54 מעלות צלזיוס) | 100 מ"ל |
| גורם מגרה מושבות מקרופאגים או M-CSF (מדיום מותנה L-929) | 150 מ"ל |
| גלוטמין | 5 מ"ל |
| נתרן פירובט | 5 מ"ל |
| β-מרקפטואנול | 0.5 מ"ל |
| פניצילין/סטרפטומיצין | 5 מ"ל |
| סך הכל | 500 מ"ל |
| 2. 500 מ"ל BMDM (מסנן מחוטא): | |
| DMEM | 235 מ"ל |
| FBS (מושבתת 30 דקות ב-54 מעלות צלזיוס) | 100 מ"ל |
| M-CSF (מדיום מוזן L-929) | 150 מ"ל |
| גלוטמין | 5 מ"ל |
| נתרן פירובט | 5 מ"ל |
| β-מרקפטואנול | 0.5 מ"ל |
| סך הכל | 500 מ"ל |
| 3. בופר AE | |
| אצטט נתרן (NaOAc) pH 5.2 | 50 מ"מ |
| אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA) | 10 מ"מ |
| מים ללא RNase | |
| 4. פנול-כלורופורם-IAA | |
| פנול | 25 מ"ל |
| כלורופורם | 24 מ"ל |
| אלכוהול איזו-אמיל | 1 מ"ל |
| 5. כלורופורם-IAA | |
| כלורופורם | 24 מ"ל |
| אלכוהול איזו-אמיל | 1 מ"ל |