חילוץ RNA מליסטריה מונוציטוגנס שנקטף ממאקרופאג'ים של עכברים נגועים

תקציר

מקור: סיגל, נ., ואחרים. טיהור RNA מ-Listeria monocytogenes תוך-תאית בתאי מקרופאג'. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון הזה מדגים חילוץ RNA מליסטריה מונוציטוגנס שבודדה ממאקרופאגים נגועים בעכברים. הפרוטוקול שומר על RNA, מפרק תאים באמצעות פנול-כלורופורם וחום, ומפריד RNA באמצעות צנטריפוגה. מלח ואתנול, בשילוב עם דגירה קרה, מקדמים את השקיעת RNA. ה-RNA המתקבל לוכד ביטוי גנים המושר על ידי המארח, וחושף אלימות חיידקית ואסטרטגיות הסתגלות.

פרוטוקול

1. הפקת חומצות גרעין

הערה: בצע את כל המניפולציות עם תמיסות פנול וכלורופורם במכסה אדים.

1. הכינו תערובת 1:1 של פנול מחומצץ: כלורופורם, 400 מיקרוליטר לכל דגימה. מערבבים בצינורות נפרדים, ואז משכו את השכבה המימית המתקבלת באמצעות שאיבה. הוסיפו 40 מיקרוליטר של 10% SDS.
2. הפשיר את הצינורות המכילים את המסנן על קרח כדי לשמור עליהם קרים. לכל צינור המכיל מסנן הוסיפו 650 מיקרוליטר של בופר אצטט-EDTA (AE) (50 מ"מ מולר NaOAc pH 5.2, 10 מ"מ EDTA, מים חופשיים מ-RNase).
3. בצע את השלבים הבאים במהירות האפשרית.
   1. מערבולת חזקה בצינור המכיל את המסנן כך שהמסנן יפגע בשולי הצינור והבופר שוטף את המסנן במלואו. תמיד תשמור על הצינור קר על ידי החזרתו על הקרח.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך גם לסבב את הצינור כשהוא הפוך כדי לשטוף לחלוטין את החיידקים מהפילטר.
   2. חזור על זה עבור כל הצינורות. ייתכן שיהיה שימושי לסובב את המתלה במהירות (דקה אחת ב-120 x g) בסוף התהליך.
4. העבר את הבופר המכיל חיידקים לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המכיל את תערובת SDS ופנול/כלורופורם. חזור על זה עבור כל הצינורות. ייתכן שיהיה צורך לסובב שוב את הצינורות המכילים את המסנן (דקה אחת ב-120 x g) כדי לקבל בופר שאריתי מהפילטר.
5. שים את כל צינורות ה-1.5 מ"ל במכשיר מערבולת רב-צינורית, ומערבולת במהירות מלאה למשך 10 דקות.
6. דגרו את הצינורות בבלוק חום של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה במהירות מקסימלית (> 14,000 x g) למשך 5 דקות.
7. העבר את שכבת המים (כ-400 מיקרוליטר) מכל צינור לצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל המכיל 40 מיקרוליטר של 3 מיליטר אצטט נתרן (pH 5.2) ו-1.0 מ"ל של 100% אתנול. סחרור כל צינור ביסודיות.
   הערה: ניתן להוסיף גליקוגן בשלב זה כדי לשפר את הדמיה של הכדור המשקע.
8. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של -80°C למשך שעה. חלופה נוספת היא לדוג דגימות בטמפרטורה של מינוס 20°C במהלך הלילה. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות בטמפרטורה של 4°C למשך 20 דקות במהירות מקסימלית (> 14,000 x g).
9. שאף בזהירות את האתנול (השכבה העליונה) מכל צינור. הוסיפו 500 מיקרוליטר אתנול קר ו-70% אתנול לכל דגימה ומערבלים היטב. צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות במהירות מקסימלית (> 1 4,000 x גרם).
10. שאף בזהירות את האתנול מכל צינור. ייבשו את הדגימות במשך כ-2 דקות באמצעות אידוי ואקום ללא חום. אל תייבש את הדגימות יותר מדי.
11. הוסף 25 מיקרוליטר מים ללא RNase לכל דגימה. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. מערבולת והסתובבות בזהירות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ליסטריה מונוציטוגנס 10403S
H2O, ללא RNAse	תרמו-סיינטיפיק	10977-015	ניתן להשתמש במים שטופלו ב-DEPC
pH רווי פנול 4.3	פישר	BP1751I-400
כלורופורם	פישר	BP1145-1
אלכוהול איזו-אמיל	סיגמא-אלדריץ'	W205702
נתרן אצטט	סיגמא-אלדריץ'	W302406
EDTA	סיגמא-אלדריץ'	EDS
SDS 10%	סיגמא-אלדריץ'	L4522
אתנול אבסולוטי	מרק מיליפור	1070174000
מסנני MF-Millipore 45 מ"מ, 0.45 מיקרון	מרק מיליפור	HAWP04700
וורטקס-ג'יני 2	תעשיות מדעיות	דגם G560E
בלוק חום של 65 מעלות צלזיוס	תרמו-סיינטיפיק
צנטריפוגה שולחנית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס	אפנדורף	5417R
פיפטות סטריליות, 25 מ"ל	גריינר
צינורות פלקון, 50 מ"ל	גריינר
צינורות 1.7 מ"ל, ללא RNase	אקסיגן	MCT-175-C
מערכת SpeedVac	תרמו-סיינטיפיק	SPD131DDA