$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים המוסדית המקומית וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. הכנת חיסון חיידקית של Escherichia coli אורופתוגנית (UPEC)
- הכינו זיהומים בדרכי השתן89 (UTI89) (התחל 72 שעות לפני יום החיסון)
- רצף UTI89 על צלחת אגר LB (לוריה-ברטני) מאגר קפוא. דגרו לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בחרו מושבה והחרינו אותה ב-10 מ"ל LB בבקבוק של 125 מ"ל. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, באופן סטטי.
- החרינו 10 מיקרוליטר של תרבית לילה לתוך 10 מ"ל LB בבקבוק חדש בנפח 125 מ"ל למשך 24 שעות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, באופן סטטי.
- העבר 3 מ"ל (משתנה בהתאם למאמץ וגודל החיסון הרצוי) לצינורות סטריליים של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב-7,000 x גרם למשך 3 דקות, והחזיר את הכדור ל-1x מלח עם בופר פוספט (PBS) וצנטריפוגה בפעם השנייה. החזירו את הכדור החיידקי ל-1 מ"ל 1x PBS.
- מדדו צפיפות אופטית חיידקית והתאימו את הריכוז לצפיפות האינוקולום הרצויה. הריכוז הסטנדרטי של החיסון הוא 107 חיידקים; עם זאת, זה עשוי להשתנות בהתאם לעיצוב המחקר.
2. חיסון חיידקים
- נקה את תחנת העבודה עם 70% אתנול וכסה את האזור בנייר סופג (או השתמש במכסה זרימה סטרילי).
- יש למשוך עד 0.9 מ"ל מהאנוקולום החיידקי המוכן למזרק של 1 מ"ל טוברקולין (TB) (הסר בועות אוויר). מחברים מחט חיסון סטרילית מוכנה עם פוליאתילן עם גודל 10 (PE10) צינור על המזרק המכיל את האינוקולום, ואז גזמו את צינור הפוליאתילן בצורה סטרילית.
הערה: השאירו 1 מ"מ צינור מעל קצה המחט כדי למנוע ניקוב בשלפוחית. - חותכים חתיכת פאראפילם מרובע בגודל אינץ' אחד ומרחו מעט חומר סיכה כירורגי (בערך בגודל של עשר אגורות) מעל.
- הרדימו עכברים נקבות עם C3H/HeN על ידי הכנסתן לתא אידוי (בהתאם לפרוטוקול היצרן) עד שהן מחוסרות הכרה אך עדיין נושמות כרגיל (נשימה אחת לשנייה).
אזהרה: איזופלוראן הוא חומר הרדמה בשאיפה. יש להשתמש באזור מאוורר היטב ולהפחית את השאיפה. - הוציאו את העכבר מהמאדה והניחו אותו על גבו על מגבת נייר ופתחו את הרגליים.
- כסו את אף העכבר בקונוס אף (צינור שמחובר לאדוי ומספק מינון איזופלוראן מבוקר שמגיע בחלק ממכשירי האידוי) כדי לשמור על ההרדמה.
- יש לדופק בעדינות את שלפוחית השתן כדי לגרום למתן שתן ולהבטיח שלפוחית השתן ריקה. נגב את אזור השופכה עם מגב 100% אתנול. טפחו את המחט/המזרק, הנקודה ראשונה, לתוך חומר הסיכה הניתוחי.
- החריקו כל עכבר ב-50 מיקרוליטר מתמיסת החיידקים על ידי הכנסת מחט ההזרקה דרך השופכה, כ-12 מ"מ, ולחיצה עדינה על הבוכנה כדי להוציא את החיסון לשלפוחית השתן (10 מיקרוליטר לשנייה). הסר את מחט החיסון מהעכבר.
הערה: חזרה מיידית של החיסון בפתח השופכה בעת תחילת ההזנה מצביעה על החדרה לא נכונה או לא שלמה של המחט. - הוציאו את העכבר מקונוס האף והחזירו לכלוב. חזור על שלבים 2.3-2.8 לכל עכבר. אם וכאשר מחליפים תנאי/זן חיסון, זרקו את המזרק ומחט החיסון במיכל חריצים מאושר והתחילו מחדש בשלב 2.2.
הערה: חיסון אורגניזמים אורופתוגנים בדרך כלל אינו גורם לתסמיני כאב חמורים. עם זאת, במקרים נדירים, מתן מינונים גבוהים של פתוגנים עלול לגרום לחום, ירידה בצריכת מזון ומים והתנהגות חריגה. יש לעקוב אחר בריאות בעלי החיים לאורך כל הניסוי. אם מופיעים תסמיני כאב גלויים, ניתן להחיל משכך כאבים, כגון בופרנורפין (0.05−0.1 מ"ג/ק"ג שניתן תת-עורית).
3. מניין קהילות חיידקיות תוך-תאיות (IBC)
- הסר את השלפוחית באופן אספטי והניח אותה ב-1x PBS בלוח עם 6 בארות עם תחתית סיליקון. ניתן להכין לוחות באמצעות ערכת אלסטומר סיליקון ולשפוך כ-1 ס"מ סיליקון בכל באר. חתוך את השלפוחית לשניים עם מספריים.
- באמצעות פינים מתכתיים קטנים, פרוש בעדינות את השלפוחית כך שהלומן של השלפוחית פונה כלפי מעלה. הקפידו למקם את הפינים בקצוות החיצוניים ביותר של חלקי שלפוחית השתן כדי להבטיח שכמות האורותליום המקסימלית נחשפה.
- אחרי הפיזור, שטפי בעדינות את שלפוחית השתן פעם אחת עם 1x PBS. הסר את ה-1x PBS של פיפט. תקן את שלפוחית השתן על ידי הוספת מספיק 3% פאראפורמלדהיד כדי לכסות את כל השלפוחית הפרושה.
אזהרה: פאראפורמלדהיד הוא סרטן. יש ללבוש ציוד מגן מתאים, כולל כפפות, בכל עת. הטיפול צריך לעמוד בהנחיות המוסדיות. - דגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה. הסר את תמיסת הפרפורמלדהיד. שטוף פעם אחת עם 1x PBS.
- שטוף עם תמיסת שטיפה LacZ (2 מ"מ MgCl2, 0.01% נתרן דאוקסיכולאט ו-0.02% נונידט-p40 ב-1x PBS) שלוש פעמים למשך 5 דקות בכל שטיפה.
- הסר את תמיסת השטיפה והוסף מספיק כתם LacZ (9.5 מ"ל תמיסת שטיפה LacZ, 0.4 מ"ל 25 מ"ג/מ"ל X-gal, ו-0.1 מ"ל של 100 מ"מ K-פרוציאניד/K-פריציאניד) כדי לכסות את השלפוחית. דגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס בלילה, מוגנים מאור.
- הסר את השלפוחית המפוזרת מהאינקובטור וצפה ב-IBCs, שמופיעים כפונקטה כחולה כפי שמוצג עם כוונת ניתוח, בהגדלה של 40-60x.
הערה: לעיתים עכבר עשוי להשתין לפני שמניחים את הצינור מתחת לשופכה. במקרה כזה, המתן 15-20 דקות לפני שתנסה לאסוף שתן שוב.