העברת שיבוטים ויראליים רקומביננטיים בתיווך אגרובקטריום לשתילי תירס להשתקת גנים

תקציר

מקור: בירנינק, ב. מ. ואחרים. הזרקה ישירה של שתילי תירס באמצעות הזרקה של וירוס הפסיפס של זנב שועל רקומביננטי ושיבוטים זיהומים של וירוס פסיפס קנה הסוכר. J. Vis. Exp. (2021)

הסרטון הזה מדגים את העברת שיבוטים ויראליים רקומביננטיים בתיווך אגרובקטריה לשתילי תירס לצורך השתקת גנים. הוא מתאר את תהליך זיהום האגרובקטרים , התפשטות וירוסית מערכתית ושינויים פנוטיפיים המונעים מהפרעות RNA.

פרוטוקול

1. הזרקה
הערה: שתילי תירס מגיל 4-7 ימים יכולים לשמש להזרקה. קצב גדילת השתילים מושפע מאוד מתנאי גדילה, כמות הקרינה הפעילה פוטוסינתטית (PAR) (כלומר, PAR גבוה יותר בחממה מאשר בתא הגידול), וגנוטיפ, בין יתר דברים שקשה לשלוט בהם בתנאי חממה. ניתן להזריק צמחים כבר מגיל 4 ימים כשהם בגובה 2-3 ס"מ ללא עלים מורחבים, ועד גיל 7 ימים כאשר העלה בעל הקצה המעוגל התחתון מתרחב. שיעור ההצלחה של שיטת החיסון הזו יורד במהירות ככל שהצמחים מזדקנים מעבר ל-7 ימים לאחר הזריעה. מקום ההזרקה זהה ללא קשר לגיל השתילים.

1. עם משקפי מגן, מזריקים את המתלים החיידקיים לשתילים בגובה 2-3 מ"מ מעל הקודקוד הקולאופטילרי באמצעות מחט בגודל 25G x 5/8" המחוברת למזרק חד-פעמי בנפח 1 מ"ל.
   הערה: הגוש הקולאופטילרי הוא המקום שבו בסופו של דבר ייווצרו שורשי הכתר. זהו הצומת הנמוך ביותר בצמח. בדרך כלל, יהיה שינוי צבע מירוק ללבן באזור ומתחת לצומת. מיקום ההזרקה נמצא ממש מעל המריסטם. ניתוח כמה שתילים בשלב זה עשוי לסייע בהמחשת מיקום המריסטם ובכך גם במיקום ההזרקה הנכון.
2. הפעילו לחץ עדין על המזרק עד שהתעלת ממלאת את הקולאופטיל או נראית בגלגול, בהתאם לשלב הצמיחה של הצמחים. זה בערך 100-200 מיקרולטר של מתלים.
   הערה: אם קשה להזריק את התלייה לנביל, אתר ההזרקה עלול להיות נמוך מדי. לחץ בינוני הוא כל מה שצריך להזריק את המתלה.
3. הזריק את כל השתילים, החלף מזרקים ומחטים לכל מבנה.

2. טיפול מתמשך בצמחים

1. העבירו את השתילים שהוזרקו לעציצים בגודל 13x13x15 ס"מ או יותר כשהם בני 7-8 ימים.
2. שמור על תנאי גדילה (16 שעות פוטופריד ודישון פעם בשבוע).

3. אישור זיהום (פנוטיפית)

1. דירוגים פנוטיפיים של צמחים בין 14 ל-21 ימים לאחר החיסון (DPI). נגעים שנגרמו מהשתקת גני הבקרה, נגע מחקה 22 או פיטואן דסאטוראז , נראים בקלות על העלים והם שונים מתסמיני FoMV.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מזרקים בגודל 1 מ"ל	פישר סיינטיפיק	14955450	לחלופין, BD 309659
Agrobacterium tumefaciens זן GV3101			נושא מנגנוני העברת T-DNA מקודדים של פלסמיד ויר, RifR, GmR, ממלאי מעבדה
דשן			פיטרס דשן 15-15-15 מרוכז
סירים גדולים	קורדלוק	SQL0550	5x5x4" או יותר. להשתלת שתילים.
תירס זהב זרעי תירס מתוק	מרעה אמריקאי, זרעי החוף המערבי
מצע הקרקע	סאנגרו הורטיקולטורה	SS#1-F1P	Sunshine Mix #1/Fafard-1P, כל תערובת אדמה שבה התירס גדל היטב מספיקה