הקמת ביופילמים חיידקיים-פטרייתיים חוצי ממלכה לחקר פתוגנזה אורלית

תקציר

מקור: Schlafer, S, ו-Frost Kristensen, M. ניטור pH חוץ-תאי בביופילמים חוצי-ממלכה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את גידול הביופילמים החוצי-ממלכותיים של Streptococcus mutans ו-Candida albicans בתנאים דמויי פה כדי למודל אינטראקציות חיידקיות–פטריות, ומאפשר חקר סינרגיה מיקרוביאלית, הידבקות מתווכת גלוקן ואלימות חומצית בפתוגנזה הפה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים איסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות ה-IRB של המכון.

1. גידול ביופילמים חוצי ממלכות

1. גדלו Streptococcus mutans (S. mutans) DSM 20523 ואת Candida albicans (C. albicans) NCPF 3179 על לוחות אגר דם בטמפרטורה של 37°C בתנאים אירוביים.
2. העבר מושבות בודדות של כל אורגניזם למבחנות, מלאות ב-5 מ"ל של עירוי לב מוחי (BHI). גדל במשך 18 שעות בתנאים אירוביים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
3. צנטריפוגה את התרביות הלילית ב-1,200 x גרם למשך 5 דקות. להשליך את הסופרנאנט, להחזיר את התאים לסליין פיזיולוגי ולהתאים את ה-OD_{550 ננומטר} ל-0.5 עבור C. albicans (~10⁷ תאים/מ"ל) ו-S. mutans (~10⁸ תאים/מ"ל). מדלל את תליית S. mutans ביחס 1:10 עם מלח פיזיולוגי סטרילי (~10⁷ תאים/מ"ל).
4. פיפט של 50 מיקרוליטר של תמיסת רוק סטרילית, לבארות של לוח תחתון אופטי עם 96 בארות למיקרוסקופיה. דגרו ל-30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שטפו את הבארות שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של מלח פיזיולוגי סטרילי. רוקן את הבארות.
5. הוסף 100 מיקרוליטר של מתלה C. albicans לכל באר. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לשטוף 3 פעמים עם מי מלח פיזיולוגיים סטריליים.
   הערה: אל תרוקן את הבארות לגמרי במהלך הכביסה. השאירו מאגר של 20 מיקרו-ליטר כדי להימנע מכוחות גזירה מופרזים.
6. הוסף 100 מיקרוליטר של סרום בקר עוברי מושבת חום (מושבתת ב-56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות) לכל באר. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לשטוף 3 פעמים עם מי מלח פיזיולוגיים סטריליים. רוקן את הבארות, ומשאיר מאגר של 20 מיקרוליטר.
7. הוסף 100 מיקרול של תלייה של S. mutans (שהוכן בשלב 1.3) לכל באר. הוסף 150 מיקרוליטר BHI המכיל 5% סוכרוז. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות או יותר. כשמגדלים ביופילמים ישנים, החליפו את המדיום מדי יום ל-BHI טרי. בסיום שלב הצמיחה הביופילם החוצה בין הממלכות, יש לשטוף 5 פעמים עם מלח פיזיולוגי סטרילי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
לוחות אגר דם	מכון הסרום סטטנס	677
עירוי מוח ללב	אוקסואיד	CM1135
עירוי מוח, לב + סוכרוז 5%	אספקת מעבדות BDH	10274
קנדידה אלביקנס	האוסף הלאומי של פטריות פתוגניות	NCPF 3179
סרום בקר עוברי	Gibco Life Technologies	10270
צנטריפוגה מקוררת GS-6R	בקמן	לא זמין
μ-לוחית 96 באר שחור	איבידי	89626
סליין פיזיולוגי סטרילי	VWR	6404
סטרפטוקוקוס מוטנס	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen	DSM 20523
ספקטרופוטומטר V-3000PC	VWR	לא זמין