$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת וופרים מסיליקון
- תכננו את הגיאומטריות של ערוץ המיקרופלואיד בתוכנת עיצוב בעזרת מחשב (CAD; ראו טבלת חומרים) והדפיסו אותה על סרט שקוף ליצירת מסכת הפוטו (איור 1A).
- יצרו את תבנית המאסטר באמצעות ליתוגרפיה רכה (בתנאי חדר נקי) בהתאם לשלבים הבאים.
- אפו את הוופל הסיליקון בטמפרטורה של 200 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
- מניחים את הווייפר במרכז ספין-קווטר ושפכו פוטוריסט SU8 3050 (ראו טבלת חומרים) על הוופר. ספין קואט ב-1,700 סל"ד ל-40 שניות עם רמפה של 10 שניות/100 סל"ד.
הערה: פרמטרי הציפוי הספין נקבעו כך שיקבלו עובי יעד של 100 מיקרון עבור SU8 3050. - לאחר תהליך הציפוי הספין, אפייה רכה של וופר הסיליקון בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 600 שניות ו-95 מעלות צלזיוס ל-2,700 שניות. תן לוופר להתקרר בטמפרטורת החדר במהלך הלילה.
הערה: הקירור בלילה משפר את ההיצמדות של ה-SU8 לוופר. - הניחו את מסכת הפוטו (שלב 1.1) על הווייפר וחשפו אותה לאור UV, עם אנרגיית חשיפה של 250 mJ/cm² ובאורך גל של 350 ננומטר.
- לאחר החשיפה, אפו את המצע החשוף בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות ו-95 מעלות ל-300 שניות.
- פיתחו את וופ הסיליקון לקבלת תבנית ראשית על ידי הטבילה בבקבוק מלא במפתח mrDev600 (ראו טבלת חומרים). נער בעדינות את הבקבוק במשך 1,800 שניות כדי לשטוף את הרזיסט הלא מפולימר. לאחר מכן, שטיפו בהתזה על ידי ריסוס איזופרופנול על הוויפר הסיליקוני וייבשו באוויר.
- אפייה קשה של הווייפר הסיליקון בטמפרטורה של 200 מעלות צלזיוס למשך 1,800 שניות.
- סילאניזציה של התבנית הראשית באמצעות הפקדת אדים של 20 מיקרוליטר סילאן טריכלורו (1H, 1H, 2H, 2H-פרפלואורוקטיל) (ראו טבלת חומרים) מונחת על מחסנית זכוכית ליד התבנית למשך 40 דקות במייבש ואקום, ויוצרים לחץ מד של 100 מ"בר.
2. ייצור מכשיר מיקרופלואידי
הערה: תהליך הייצור המתואר כאן הוא עבור מכשיר מיקרופלואידי עם ערוץ מיקרופלואידי אחד. עם זאת, ניתן ליישם את אותה שיטה לייצור מכשיר מיקרופלואידי עם מספר ערוצים מיקרופלואידיים במקביל.
- ערבבו את האלסטומר עם הקרוסלינקר שלו ביחס של 10:1 (ראו טבלת חומרים) להכנת תערובת פולידימתילסילוקסן (PDMS). ערבבו את התערובת עד שהיא מתערבבת באופן אחיד והופכת לאטומה בגלל בועות האוויר הסגורות.
- יש להסיר גזים מהתערובת במייבש ואקום, וליצור לחץ מד של 100 מ"בר עד שהבועות הכלואות מוסרות והיא נראית שקופה. הזמן הנדרש לפירוק גזים הוא בדרך כלל 30 דקות.
- הניחו את התבנית הראשית (שלב 1) בצלחת תרבית תאים (ראו טבלת חומרים). שפוך 20 גרם מתערובת PDMS על התבנית הראשית ליצירת תעלות בעובי סופי של 5 מ"מ.
- אפה את תבנית המאסטר בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- חתכו את ה-PDMS המקוריים סביב ערוץ המיקרופלואיד (במרחק של כ-3 מ"מ) באמצעות להב, ואז קילפו את ערוץ המיקרופלואיד של PDMS מהתבנית הראשית.
- כדי ליצור את הכניסה והיציאה של התעלות המיקרופלואידיות, יש לחורר חורים עם חור ביופסיה (קוטר 1.5 מ"מ) בקצוותיו (ראש המשולשים, ראו איור 1A). חור חור נוסף במרכז משולש הכניסה כדי להתקין את חיישן הלחץ מאוחר יותר.
- שטפו מזכוכית ותעלה מיקרופלואידית עם תמיסת דטרגנט 1% זמינה מסחרית (ראו טבלת חומרים) למשך 5 דקות, ואז שטפו אותם במים דה-יוניים. לאחר מכן, שטפו את ערוץ המיקרופלואיד PDMS ואת סלייד הזכוכית עם איזופרופנול. לאחר מכן, שטוף אותם שוב במים דה-יוניים. ייבשו את ערוץ המיקרופלואיד של PDMS ואת סלייד הזכוכית עם אוויר דחוס ב-1 בר למשך דקה.
הערה: המבנה הנקבובי של ה-PDMS חייב להיות יבש לחלוטין כדי שהקישור יהיה יעיל. - הניחו את מחסנית הזכוכית ואת תעלת המיקרופלואיד במנקה פלזמה (ראו טבלת חומרים) וודאו שהמשטחים שיש לחבר פונים כלפי מעלה. הפעל את מנקה הפלזמה וטיפל בערוץ המיקרופלואיד ובמחסנית הזכוכית בפלזמת אוויר בזרימת אוויר של 1 SL/h (ליטר סטנדרטי לשעה) למשך דקה. חבר את ערוץ המיקרופלואיד למחסנית הזכוכית מיד לאחר שהוציאתם אותם מהמנקה על ידי הצבתם במגע זה עם זה.
הערה: ודא שלא נוגעים במשטחים המטופלים, שכן זה עלול להשפיע על ההדבקה. כאשר מייצרים מכשיר מיקרופלואידי עם מספר ערוצים מיקרופלואידיים, חשפו את התעלות המיקרופלואידיות בו-זמנית וקשרו אותם בשלב אחד. - הנח את המכשיר המיקרופלואידי המודבק על פלטת חימום של 80 מעלות צלזיוס למשך לפחות 15 דקות.
- אחסן את המכשיר המיקרופלואידי בצלחת תרבית תאים נקייה עד שהניסוי יתחיל.
3. הכנת השעון החיידקי
- גידול אוכלוסייה של Bacillus subtilis NCIB 3610 למשך 20 שעות לפני תחילת הניסוי על ידי חיסון ישיר של 3 מ"ל מדיום תרבית מרק מזינים מס' 3 (ראו טבלת חומרים) ממלאי גליצרול קפוא בצינור תרבית בנפח 15 מ"ל. דגרו באינקובטור מנענע בטמפרטורה של 30°C ו-200 סל"ד במהלך הלילה (למשך 16 שעות).
- יצר תת-תרבית מהתרבית הלילית 4 שעות לפני תחילת הניסוי על ידי הוספת 3 מיקרו ליטר מהתרבית הלילית ב-3 מ"ל מדיום תרבית טרי (דילול של 1:1,000) בצינור תרבית של 15 מ"ל. דגרו את תת-התרבות באינקובטור רועד בטמפרטורה של 30°C ב-200 סל"ד למשך 3.5-4 שעות כדי לקבל צפיפות אופטית ב-600 ננומטר (OD₆₀₀₀) של 0.1.
4. ניסוי גידול ביופילם
- הפעילו את האינקובטור של המיקרוסקופ 3 שעות לפני הניסוי כדי להבטיח טמפרטורה יציבה של 25 מעלות צלזיוס. התקינו את משאבת המזרק ואת חיישני הלחץ (ראו טבלת חומרים).
- חבר את צינור הכניסה והיציאה למכשיר המיקרופלואידי. הכנס ישירות מחט (בקוטר חיצוני של 0.6 מ"מ) לצינור הכניסה כדי לאבטח את החיבור בין הצינור למזרק.
- הניחו את המכשיר המיקרופלואידי, 30 מ"ל מים דה-יוננים ו-30 מ"ל מדיום תרבית במייבש ואקום ונסו להסיר גזים לפחות לשעה. לאחר מכן, למשוך לאט לאט את מדיום התרבית ואת המים המיוננים לשני מזרקים נפרדים בנפח 30 מ"ל.
הערה: שלב זה חיוני למניעת היווצרות בועות בתעלה בזמן שטיפה עם מדיום התרבית. - התקן את המכשיר המיקרופלואידי על מיקרוסקופ והניח את צינור היציאה במיכל פסולת.
- חבר את המזרק המלא במים דה-יוניים לתעלה המיקרופלואידית דרך צינור המיקרופלואיד והזריק את המים לאט עד שהם יוצאים מיציאת חיישן הלחץ. מלא את חיישן הלחץ במים ושוטף את כל הבועות מהצינור שמחבר בין ערוץ המיקרופלואיד לחיישן הלחץ. סגור את היציאה של חיישן הלחץ עם הברגים המוקדשים לחיישן.
הערה: הליך המילוי המתואר מבטיח ששינויים בלחץ בכניסת תעלות המיקרופלואיד יתועדו במדויק. בעת ביצוע ניסוי עם מספר ערוצים מיקרופלואידיים, יש לחבר כל ערוץ למזרק נפרד כדי להבטיח תנאי זרימה שווים בכל הערוצים.
- מלאו את שאר תעלת המיקרופלואיד במים המנוטרים.
- הניחו מסנן 1.2 מיקרון (ראו טבלת חומרים) על מזרק המדיה התרבותית. לאחר מכן, הסר את מזרק המים וחבר בזהירות את מזרק המדיה לתרבות לצינור המיקרופלואיד של הכניסה. התקן את המזרק על משאבת המזרק ושטף את התעלה עם תווך התרבות בקצב זרימה של 2 מ"ל לשעה למשך שעה.
הערה: המסנן מונע מתאי חיידק להיכנס למזרק במהלך הטעינה. שטיפת תעלת המיקרופלואיד עם מדיום התרבית תסיר את הבועות שנותרו במבנה הנקבובי. - כוון את משאבת המזרק לקצב הזרימה הרצוי (כאן 1 מ"ל/שעה) במהלך הניסוי והגדר את קריאת הלחץ של חיישני הלחץ לאפס.
הערה: על ידי הגדרת קריאת הלחץ ההתחלתית לאפס, יימדד רק הפרש הלחץ שנגרם מהתפתחות ביופילם במהלך הניסוי. - פיפטה של 1 מ"ל של תרבית החיידקים ב-OD₆₀₀₀ של 0.1 לתוך בקבוקון צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. טען את תרבית החיידקים לתעלה המיקרופלואידית על ידי הנחת צינור היציאה לבקבוק הצנטריפוגה. לאחר המתנה של 5 דקות להסרת בועות אוויר פוטנציאליות מיציאת הצינורות, שאבו 150 מיקרוליטר של תמיסת חיידקים בקצב זרימה של 1 מ"ל לשעה, עד שהתעלה המיקרופלואידית מתמלאת בתרבות החיידקים.
- הסר בזהירות את מסנן מזרק התרבות והכנס את היציאה למיכל הפסולת. השאירו את תאי החיידקים בתנאי זרימה אפסית בתעלה המיקרופלואידית למשך 3 שעות כדי לאפשר את ההצמדה החיצונית שלהם בתווך הנקבובי.
הערה: השארת תאי החיידקים בתנאי זרימה אפסית למשך 3 שעות הייתה אופטימלית להצמדת הזן החיידקי תוך הבטחת תרבית חיידקים מחומצנת היטב. זנים חיידקיים אחרים עשויים לדרוש יותר או פחות זמן. - כדי להתחיל את הניסוי, התחילו את הזרימה על ידי כוונון משאבת המזרק לקצב הזרימה הרצוי (כאן 1 מ"ל לשעה) ולהתחיל את קריאת הלחץ ב-1 הרץ.
- לצלם תמונות של הביופילם המתפתח בפרק הזמן הרצוי, תצורה אופטית והגדלה.
הערה: במחקר הנוכחי, צולמו תמונות בהגדלה פי 4 במצב שדה בהיר ב-18 מיקומים המכסים את כל תחום המדיום הנקבובי כל 6 דקות למשך 24 שעות.
