הערכה מבוססת מיקרוסקופיה של היצמדות חיידקים למשטחי שורשי הצמחים

תקציר

מקור: Matthysse, A. G. היצמדות חיידקים למשטחי צמחים שנמדדה במעבדה. J. Vis. Exp. (2018).

הסרטון הזה מדגים את הערכת ההיצמדות החיידקית לשורשי הצמח באמצעות מיקרוסקופ פאזה-ניגודיות. דגימות שורשים משתילים שדגרו עם חיידקים מורכבות תחילה כדי לבדוק אם יש חיידקים חופשיים. הדגימות נשטפות להסרת חיידקים שמחוברים ברפיון ומותקנות מחדש באמצעות כיסוי מתאים למניעת נזק. לבסוף, מספר החיידקים המחוברים לשערות השורש נספר תחת מיקרוסקופ.

פרוטוקול

1. חיסון החיידקים

1. קבעו את מספר החיידקים שיש לחסן אותם בהתייחס למדידה שתשמש לקביעת הידבקות החיידקים ואורך זמן הדגירה.
2. למחקרים מיקרוסקופיים הכוללים זמני דגירה קצרים מיום אחד, יש לחסן כמויות יחסית גדולות של חיידקים. הוסיפו כמות של תרבית כדי להגיע לריכוז חיידקים סופי של יותר מ-10⁶ חיידקים למיליל. לזמני דגירה ארוכים יותר, הקטין את גודל החיסון החיידקי.
3. למחקרים שבהם הידבקות חיידקית תימדד לפי ספירות תאים ברות-קיימא, יש להוסיף כמות תרבית כדי להגיע לריכוז חיידקי סופי של 10³ עד 10⁶ חיידקים למילילטר.
4. הימנע מהוספת כל כך הרבה חיידקים שהמטבוליזם שלהם ישנה את ה-pH או ריכוז החמצן במדיום הדגירה. מדדו pH באמצעות נייר pH או אלקטרודה. מדדו את ריכוז החמצן באמצעות אלקטרודת חמצן.
5. לצמחים שגדלים בחול, יש לחסן בשלוש דרכים אפשריות.
   1. הסנן את הזרע בחיידקים לפני השתילה על ידי השריית הזרעים למשך דקה במים של כ-10^{עד 6} חיידקים למיליטר.
   2. חיסון את השורש על ידי נביטת שתילים אקסניים. כאשר שורש הנבט באורך של כ-1 ס"מ, טבלו אותו או הניחו את כל השתיל במים של^10-6 חיידקים למיליטר למשך דקה.
   3. חיסון את החול על ידי ערבוב החיידקים עם החול לפני השתילה כדי לקבל ריכוז סופי של כ-10-3 חיידקים למ"ל, או על ידי השקיית הנבט במתלה של 10-6 חיידקים למ"ל לאחר השתילה.

2. דגירה של החיידקים עם החומר הצמחי

1. לצורך דגירה במדיה נוזלית, יש לדגור את החיידקים עם חומר הצמח במים סטריליים או סוכרוז ומלחים מינרליים או בתווך תרבית רקמות צמחים (כגון דילול של 1:10 של תערובת מלח בסיס מורשיגה וסקוג או מלחי MS).
   1. השתמש במיכל שאליו החיידקים לא נדבקים. נסו לשמור על פני הצמח מכוסים באופן רציף, בין אם בטבילה או בערבוב עדין. ערבוב עז עשוי למנוע הידבקות או אפילו להסיר חיידקים מפני הצמח.
   2. התבונן בחומר הצמח במיקרוסקופ האור לאחר מרווחי זמן משתנים כדי לקבוע מתי להפסיק את הדגירה ולבצע מדידות. מסלול זמן של הידבקות הוא לעיתים קרובות בעל ערך, כאשר דגימות נלקחות כל 1 עד 4 שעות או כל יום, בהתאם למהירות האינטראקציה.
2. כדי לדגור בחול, יש ליישם את אותם שיקולים שתוארו לדגירה במדיום נוזלי בשלב 2.1.

3. מדידת הידבקות באמצעות מיקרוסקופיה

1. בצע מדידות מיקרוסקופיות עם אופטיקה בנומרסקי או אופטיקת פאזה-ניגודיות לצפייה נוחה של החיידקים על משטחים. עם זאת, ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ בעל שדה בהיר עם הגדלה של פי 20 או יותר.
   1. השתמש בתצפית מיקרוסקופית כדי לקבוע אם החיידקים מפוזרים באקראי או ממוקמים באתרים מסוימים. כמו כן, בדוק אם הם קשורים לבד או באשכולות. חפש נוכחות של מיקרוקולוניות המצביעות על צמיחה או לכידה חיידקית לאחר ההידבקות. בדוק אם החיידקים יוצרים ביופילם על פני השטח.
      הערה: ביופילם הוא מספר רב של חיידקים הקשורים לפני השטח ומוקפים במטריצה חוץ-תאית. המבנה עשוי להיות חלק ואחיד או בעל ארכיטקטורה מורכבת יותר.
   2. השתמש בחיידקים שמסומנים בסמן פלואורסצנטי. אם קיימים חיידקים אחרים והחיידקים הרלוונטיים מזוהים באמצעות תג פלואורסצנטי כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), יש להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע את נוכחות החיידקים המסומנים באשכולות של חיידקים אחרים. ל-GFP, השתמש במסנן עם עירור של 490 ננומטר ופליטה של 520 ננומטר.
      1. בדוק אם התג הפלואורסצנטי אינו פוגע בחיידקים על ידי התבוננות בהיצמדות לחומר אקסני של תערובת שווה של חיידקים מסוג בר וחיידקים מסומנים מאותו זן, באמצעות אופטיקה של נומרסקי ופלואורסצנציה. אם החיידקים הפלואורסצנטיים והכהים מעורבבים באקראי ונוכחים במספרים שווים, אז התג לא הפריע לבדיקה.
2. קבעו את מספר החיידקים המחוברים.
   הערה: קשה מאוד לקבוע את מספר החיידקים המחוברים במיקרוסקופ. כאשר הקשר הוא למשטחים לא סדירים של צמחים, בדרך כלל לא ניתן לקבל מדידה כמותית. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (שלא נדון במאמר זה) יכול לשמש לביצוע מדידות כאלה.
   1. כאשר החיידקים קשורים למשטח חלק, כמו שערת שורש, ספרו את מספר החיידקים הקשורים לקצה שערת השורש לכל מ"מ לאורך שיער שורש. הקפד להשתמש בשערות שורש בגודל וצורה דומים בהשוואת מידות.
   2. כדי לקבוע את גודל האובייקטים במיקרוסקופ, השתמשו בשקופית מסחרית עם סימונים מדודים. צפו וצילמו את השקופית באותן הגדרות ששימשו לחומר הניסוי והשתמשו בתמונות המתקבלות כדי לקבוע את גודל האובייקטים בפוטומיקרוגרפים.
3. הכינו את הדגימה למיקרוסקופיה.
   1. שטוף את הדגימה. העבר את הדגימה לטיפה של מים או מדיום דגירה על מגף מיקרוסקופ והתבונן בה ישירות.
      הערה: יש לכך את היתרון שאם לא הייתה צמיחה חיידקית או מוות אמיתי, סביר להניח שלא יהיו הרבה חיידקים חופשיים. קחו את היעדר חיידקים חופשיים כסימן אזהרה לכך שייתכן שהיה מוות חיידקי או קישור חיידקי למיכל שבו בוצעה הדגירה. השפעת שטיפת הדגימה מוצגת באיור 1.
   2. שטפו את הדגימה בעדינות במים או במדיום דגירה על ידי הנחתה בבקבוקון נוזלי והפיכת הבקבוקון בעדינות. לאחר מכן מניחים את הדגימה על שקופית המיקרוסקופ בנוזל טרי לתצפית.
   3. התקן את הדגימה בנוזל באמצעות כיסוי רגיל ומחסנית מיקרוסקופ.
      1. אם הדגימה עבה ולכן תגרום לבליטה מתחת לכיסוי הכיסוי, השתמש בכיסוי ללחיצה ומניחה. לכיסוי זה יש טבעת גומי או פלסטיק סביב קצה הכיסוי. הנח את הנוזל והדגימה בבאר בכיסוי הכיסוי, ואז מניח את המחסנית מעל ולחץ בעדינות כדי לאטום את הכיסוי למחסנית. הפוך ובדוק.
      2. חלופה נוספת היא להשתמש במגלש ספירת אצות וכיסוי באותו אופן. יש לשים לב שסליידס עם עומק זה בדרך כלל לא ניתן לבחון עם עדשה אובייקטיבית בהגדלה גדולה מ-20x.

תוצאות

איור 1: שלבים בהכנת דגימה לקביעת מספר החיידקים הקשורים. Agrobacterium tumefaciens שנקשר לשערות שורש עגבניות (A, B ו-C) ולחוטי ניילון (D, E ו-F). בדגימות המותקנות במים ללא רחצה, ניתן לראות גם חיידקים קשורים (חצים שחורים) וגם חיידקים ח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרוסקופ אור	כל	לא זמין	אופטיקת פאזה או אופטיקת נומרסקי מועילה, ובמחקרים המשתמשים בסמנים פלואורסצנטיים נדרש מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
זרעים	כל	לא זמין	רשום את מספר הזרעים ואת הזן
אקונומיקה	כל	לא זמין
סוניקטור באת'	כל חברת אספקה מדעית	לא זמין
טריטון X-100	סיגמא-אלדריץ'	T9284
אגר מזין	דיפקו	2001-01-08
סויטון	דיפקו	24360
חול	חול ים פישר סיינטיפיק	S25
חול	סיגמא-אלדריץ'	S9887
מכולות	Stuewe & Sons, Inc.	קרני קונוס ריי-ליץ'	קיימים גדלים רבים ושונים שמתאימים לסוג הצמח שתרצו לגדל
פאראפילם	כל חברת אספקה מדעית	לא זמין
מלחי טרשת נפוצה	סיגמא-אלדריץ'	M5524
תא ספירת סדג'וויק-רפטר	האוזר סיינטיפיק	HS3800
תא אינקובאטין עם קליפס לחיצת לחץ-חותם	סיגמא-אלדריץ'	Z359483
ריפמפיצין	סיגמא-אלדריץ'	R3501