יצירת גרגירי לחץ במהלך זיהום שיגלה בתאי אפיתל סרטניים

תקציר

מקור: וונאש, פ. ואח', ניתוח אימונופלואורסצנציה של יצירת גרנולות לחץ לאחר אתגר חיידקי של תאי יונקים. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את זיהום תאי האפיתל בחיידק הפתוגני Shigella flexneri ואת תגובת התאים המארחת שנוצרת. חלבוני אפקטור חיידקיים משבשים את תרגום המארח, וגורמים להיווצרות אברונים חסרי ממברנה הנקראים גרגירי מאמצים, המשקפים את תגובת התא האדפטיבית לזיהום.

פרוטוקול

1. הכנת חיידקים ותאי מארח

1. העבר שכבות זכוכית בקוטר 12 או 14 מ"מ בלוחות עם 24 או 12 בארות, בהתאמה, עם פינצטה סטרילית, וסופרים באר אחת לכל תנאי ניסוי. חטא אותם בטיפול אולטרה סגול (UV) בקפוצ'ון תרבית רקמה למשך 15 דקות.
   הערה: כולל בארות בקרה לאתגר חיידקי ולהשראה של גרגירי מאמץ (SG) על ידי מאמצים חיצוניים.
2. לפלטת 24 בארות עם כיסויי 12 מ"מ, זרעו 1 x^{10 תאים} יונקים (למשל, תאי HeLa) על כיסויי כיסוי; לחץ את הכיסוי למטה עם קצה פיפטה סטרילי. תן לתאים להיצמד ללילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמה עם 5%_CO2 במדיום תרבית המתאים לכל סוג תא.
   הערה: תאי לוחות כך שמפגש התאים יהיה בין 40 ל-60% ביום הבא.
   1. לתאי HeLa, יש לדגור במדיום Eagle (DMEM) המותאם של Dulbecco עם חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) וסרום עגל עוברי (FCS) ללא משלים של 10%. הפחית את ה-FCS על ידי חימום למשך 30 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס, וסובב את הסרום פעם אחת אחרי 15 דקות.
3. כדי להוציא חיידקים, השתמשו בקצה פיפטה סטרילית כדי להסיר כמות קטנה ממאגר גליצרול חיידקי (20% גליצרול) המאוחסן במקפיא של מינוס 80°C ומניחים אותו על צלחת מסומנת. השתמש בלולאה סטרילית כדי לפזר את החיידקים על כ-10% מהצלחת. השתמשו בלולאה סטרילית חדשה וגררו אותה דרך הממרח כדי ליצור 3 קווים מקבילים, באורך חצי צלחת. רצף דרך הקווים האלה, מכסה את שאר הפלטה. דגירה של לוח O/N ב-37°C.
   1. בחר מושבה חיידקית אחת (למשל, Shigella flexneri) מהצלחת הטרייה עם פסים. הימנעו מעבודה עם מושבות חיידקים מעל שבוע.
   2. לזן S. flexneri M90T, יש להחרין מושבה אדומה מפלטת אגואר טריפטית טריפטית של אגואר אדום 0.1% לתוך 8 מ"ל מרק סויה טריפטית בצינור של 15 מ"ל; הדק את המכסה ודוגר ניעור במהירות 222 סל"ד O/N ב-30 °C. זהירות: אין להשתמש במושבות לבנות גדולות שכן הן איבדו את הפלסמיד האלימות ואינן מדביקות.

2. אתגר חיידקי של תאי המארח

1. הכינו חיידקים כדי למקסם את פוטנציאל ההדבקה.
   1. עבור S. flexneri, תת-תרבית חיידקים על ידי הוספת תרבית O/N של 150 מיקרו ל-8 מ"ל אגר סויה טריפטי וניעור דגירה ב-222 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס לשלב האקספוננציאלי המאוחר (~2 שעות) כדי לעודד ביטוי גנים של אלימות ולהגביר את ההדבקה.
      1. כאשר התרבית בצפיפות אופטית בין 0.6 ל-0.9 (נמדדת ב-600 ננומטר), העבר 1 מ"ל של תרבית לצינור בנפח 1.5 מ"ל. חיידקי פלט למשך 2 דקות במינון 8,000 x גרם והשהייה מחדש במדיום זיהום (DMEM עם NEAA, ללא FCS) ב-OD₆₀₀ = 1. לכן, אם ה-OD₆₀₀ הוא 0.85, יש להחזיר את ההשעה ב-850 מיקרוליטר.
         הערה: עבור S. flexneri, ב-OD₆₀₀ = 1, יהיו^{8 x} 10 8 חיידקים למילילטר כאשר מתרבתים ב-8 מ"ל. ריבוי זיהום (MOI) של 20 הוא מתאים. לפתוגנים אחרים, יש לקבוע אמפירית את מספר החיידקים למילילטר_{ב-OD 600} ואת ה-MOI המתאים.
   2. כדי לשפר את האינטראקציות בין חיידקים למארח, מצפים חיידקים בפולי-L-ליזין (PLL).
      הערה: טיפול ב-PLL ב-S. flexneri לא השפיע על דינמיקת SG. פתוגנים אחרים צריכים להיות מוערכים לפי יכולתם לטיפול ב-PLL.
      1. כדי לצפות חיידקים ב-PLL, צנטריפוגה של 1 מ"ל תרבית חיידקים למשך 2 דקות בעוצמה של 8,000 x גרם ואז תלויים מחדש את הכדור ב-10 מיקרוגרם/מ"ל PLL במי מלח מפופר-פוספט (PBS) ב-OD₆₀₀ = 1.
      2. הוסף את תמיסת החיידקים לצלחת קטנה, כמו באר בתוך צלחת של 12 בארות, ודגר ב-RT (~ 20 מעלות צלזיוס) במשך 10 דקות עם ערבוב עדין על מנער צלחות.
      3. חיידקי פלט למשך 2 דקות ב-8,000 x גרם, הסר את עודפי ה-PLL. תלה מחדש את הכדור ב-1 מ"ל PBS וחזור על שלב הכביסה פעמיים. לאחר השטיפה הסופית, יש להשעות שוב במדיום הזיהום ב-OD₆₀₀ = 1.
         הערה: כאן, מדיום ההדבקה של S. flexneri הוא מדיום תא מארח עם 20 מ"מ N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-אתןסולפוניק חומצה) (HEPES) ללא FCS.
2. הכינו תאים לאתגר חיידקים.
   1. הסר מדיום מתאי HeLa של יונקים באמצעות משאבת יניקה. הוסיפו 500 מיקרוליטר מדיום תאי RT HeLa לשטיפת התאים, סובבו, הסרו את המדיום באמצעות משאבת יניקה, והחליפו במדיום זיהום מתאים לטמפרטורת החדר (RT) בטמפרטורה של 500 מיקרולטר (למשל, מדיום תא מארח עם 20 מ"מ מ' HEPES ללא FCS).
   2. הערה: בכל שלבי הכביסה, יש לעבוד במהירות ולעבד רק עד 4 כיסויי כיסוי בכל פעם כדי למנוע ייבוש התאים.
3. אתגר הכין תאי HeLa עם חיידקים כדי להדביק 20-50% מהתאים.
   הערה: יש לקבוע את הזמן וה-MOI המתאימים לכל מין חיידק. בדרך כלל, התחלה טובה היא 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם MOI של 10.
   1. עבור S. flexneri, יש לאתגר את תאי HeLa באמצעות אחת משתי השיטות (שלב 2.3.1.1 או 2.3.1.2).
      1. סובב חיידקים שאינם מטופלים ב-PLL (20 מיקרוליטר OD₆₀₀ = 1/באר של צלחת 24 בארות במדיום של 500 מיקרוליטר) על תאים למשך 10 דקות ב-13000 x גרם.
      2. הוסיפו חיידקים מצופים PLL (15 מיקרוליטר OD₆₀₀ = 1/באר של צלחת 24 בארות במדיום של 500 מיקרוליטר) למשך 15 דקות ב-RT כדי לאפשר לחיידקים להתיישב על התאים.
   2. אפשר לזיהום להתרחש על ידי הכנסת תאים עם חיידקים יציבים לאינקובטור תרבית רקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      הערה: לנקודות זמן קצרות, סנכרנו את זיהום S. flexneri על ידי הנחת צלחות באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות במקום בדוגמת תרבית הרקמות.
4. לעצור את הזיהום על ידי שטיפת תאים.
   1. כדי לשטוף תאים ולהסיר חיידקים עודפים, הסר את המדיום באמצעות משאבת יניקה, הוסיף 1 מ"ל מדיום תרבית HeLa (DMEM, 10% FCS, NEAA) מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס). סובבו את המדיום, הסרו והחליפו במדיום טרי. חזור פעמיים והשאר מדיום טרי על התאים.
      1. עבור S. flexneri, או חיידקים תוך-תאיים אחרים, לאחר הדבקה בתאי HeLa והשטיפות יש להחליף את המדיום במדיום תרבית רקמה סטנדרטי המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמצין כדי להרוג חיידקים חוץ-תאיים ולמנוע פלישה נוספת של תאים.
         הערה: אל תוסיפו אנטיביוטיקה למדיום של חיידקים חוץ-תאיים.
5. דגרו חיידקים עם תאים למשך הזמן הרצוי באינקובטור תרבית רקמה.
   הערה: אצל S. flexneri, הזיהום יכול להימשך עד 6 שעות, בהתאם לסוג התא. לתאי HeLa, ניתן לזיהום להימשך 1.5 - 2 שעות לפני הוספת מאמצים חיצוניים ליצירת SG. לזיהומי Caco-2, שבהם שיגלה מתפשט בין תאים, יש להדביק במשך 30 דקות עד 6 שעות לפני הוספת לחץ חיצוני. ניתן לקבוע את התאים בנקודה זו ללא הוספת לחצים חיצוניים להערכת היווצרות SGs כתוצאה מהזיהום החיידקי.

3. ניתוח קיבוע ואימונופלואורסצנציה של יצירת גרנולות מאמץ

הערה: עבדו את הכיסוי הביקורתי והניסיוני בו זמנית כדי למנוע הבדלי צביעה שעלולים להשפיע על ניתוח התמונה בשלבים הבאים. דגימות הביקורת כוללות ללא זיהום עם ובלי טיפול הגורם ל-SG, ודגימות נגועות עם ובלי טיפול הגורם ל-SG.

1. הסר את המדיום לחלוטין באמצעות משאבת יניקה וקבע דגימות על ידי הוספת 0.5 מ"ל RT 4% פאראפורמלדהיד (PFA) ב-PBS. תדגר ל-30 דקות ב-RT.
   אזהרה: PFA מזיק למטפל ולסביבה. נקוט צעדים מתאימים להגנה על המטפל ולהיפטר מפסולת כימית.
   הערה: חלופה נוספת היא לקבע ל-15 דקות ואז להחליף במתנול מקורר מראש בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לשמור על מיקום ציטופלזמי יותר של סמני SG.
2. הסר את ה-PFA עם פיפטה והשליך את הנוזל במיכל פסולת מתאים. שטוף את הכיסוי עם 1 מ"ל סליין טריס-בופר (TBS: 25 mM Tris, pH 7.3; 15mM sodium chloride, NaCl). דגור את הכיסוי למשך 2 דקות עם ניעור עדין על מנער צלחת בזמן הכביסה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שיגלה פלקסנרי			זמין ממעבדות שונות לפי בקשה
מרק טריפטון קזאין סויה (TCS)	BD ביוסיינסס	211825	מדיום גידול סטנדרטי לשיגלה, יישום - גידול חיידקים
אגר TCS	BD ביוסיינסס	236950	אגר גדילה סטנדרטי לשיגלה, יישום - גידול חיידקים
קונגו אדום	SERVA אלקטרופורזה GmbH	27215.01	כלי להבחנה עבור שיגלה שאיבד את הפלסמיד האלימות - יישום - גידול חיידקים
פולי-אל-ליסין (PLL)	סיגמא-אלדריץ'	P1274	שימושי לציפוי חיידקים להגברת זיהום, יישום - זיהום
גנטמיצין	סיגמא-אלדריץ'	G1397	הרג סלקטיבי של חיידקים חוץ-תאיים אך לא ציטוזוליים, יישום - זיהום
HEPES	טכנולוגיות חיים	15630-056	בופר pH שימושי כאשר תאים מודגרים ב-RT, יישום - תרבית תאים
ה-Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco ששודרג	טכנולוגיות חיים	31885	מדיום תרבית סטנדרטי לתאי HeLa, יישום - תרבית תאים
סרום עגל עוברי (FCS)	ביוווסט	S1810-100	תוספת של 5% לשימוש במדיום תרבית תאים של HeLa, יישום - תרבית תאים
חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)	טכנולוגיות חיים	11140	דילול 1:100 המשמש למדיום תרבית תאים HeLa, יישום - תרבית תאים
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	סיגמא-אלדריץ'	D2650	מדלל תגובה, יישום - תרבית תאים
פאראפורמלדהיד (PFA)	סצ'נסים במיקרוסקופ אלקטרונים	15714	4% PFA משמש לקיבוע סטנדרטי של תאים, יישום - קיבוע
לוח תרבית תאים עם 24 בארים	סיגמא-אלדריץ'	CLS3527	לוחות תרבית רקמה סטנדרטיים, יישום - תרבית תאים
כיסויי זכוכית בקוטר 12 מ"מ	NeuVitro	1001/12	תמיכה בתרביות תאים ליישומים אימונופלואורסצנטיים, יישום - תמיכה בתא
מלקחיים	סיגמא-אלדריץ'	81381	מדיום התקנה זול ועמיד שעובד טוב לרוב הפלואורופורים, יישום - התקנה