הדמיית פלואורסצנציה של קולוניזציה חיידקית ברקמת כליה בעכברים

תקציר

מקור: בהרה, ר. ק. ואחרים. שיטה מבוססת פלואורסצנציה לחקר ויסות גנים של חיידקים ברקמות נגועות. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים שיטה להכנת רקמת כליה נגועה בעכברים, צביעת DNA וזיהוי ביטוי גנים של חיידקים באמצעות דיווחים פלואורסצנטיים כפולים. אדום מסמן את כל החיידקים, והירוק מדגיש תאים המגיבים לזיהום.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הבחינה האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. איסוף האיברים ועיבוד הרקמות
   1. המית את בעלי החיים באמצעות שאיפת_CO2 והפרקת צוואר הרחם כשיטה משנית, וביצוע נתיחה.
   2. אספו את הכליה (מימין) ואיברים חיוניים נוספים (לב, כבד, ריאות, טחול) והעבירו לצינורות פוליפרופילן בנפח 15 מ"ל המכילות 10% פורמלין מופרץ [v/v].
   3. אפשר לאיברים להתייצב בחושך בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין או סיבוב למשך לפחות 24 שעות אך לא יותר מ-48 שעות.
   4. הטמיעו איברים במדיום שקוף להקפאת רקמות ואחסנו את הרקמות בטמפרטורה של -80°C.
   5. באמצעות קריוסטט, חתך רקמה לפרוסות בעובי 10 מיקרון.
   6. ייבשו את החלקים על מגלש זכוכית טעונה ומנוקה מראש למשך 20 דקות בחושך. מרח מדיום קשיח עם צבע 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) וכיסוי כיסוי. מחסניות מותקנות בטמפרטורת החדר במהלך הלילה ועוברות ל-4°C לאחסון ארוך טווח.
2. מיקרוסקופיה קונפוקלית בסריקת לייזר ועיבוד תמונה
   1. בדקו שקופיות מותקנות כדי לאתר נגעים באמצעות לייזרים המתאימים לדיווח הפלואורסצנטי שבו משתמשים. במקרה זה, משתמשים באותות הפלואורסצנציה הירוקים (GFP או חלבון פלואורסצנטי ירוק), אדום (tdTomato) וכחול (DAPI).
   2. רכוש את התמונה באמצעות המטרה המתאימה להצגת תאים בודדים (למשל, בדרך כלל משתמשים באובייקטים של 20x או 40x).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכברים C57Bl/6	נהר צ'ארלס	NA
מיקרוסקופ סורק לייזר קונפוקלי	צייס	NA
מיקרוטום קריוסטט	תרמו-סיינטיפיק	NA
סליין עם בופר זרחן (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
הומוגניזר פרסליס 24	מעבדות ברטין	NA
מדיום הקפאת רקמות שקופות Sub Xero	מרצדס מדיקל	MER5000
שקופיות מיקרוסקופ Superfrost Plus	פישר סיינטיפיק	12-550-15
מדיום הרכבה נגד פייד של Vectashield עם DAPI	מעבדות וקטור	H-1500