שינויים מורפולוגיים בהדמיית חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה של תאים חיים

Abstract

מקור: ברזוזובסקי, ר. ס. ואחרים. מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של תאים חיים לחקר מיקום חלבונים תת-תאיים ושינויים במורפולוגיה של תאים בחיידקים. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים מיקרוסקופיה פלואורסצנציונית של תאים חיים כדי להמחיש שינויים מורפולוגיים בזמן אמת בחיידקים. הוא מפרט את השלבים הכרוכים בהדמיה, רכישת טיימ-לאפס ודקונבולוציה לקבלת תמונות ברזולוציה גבוהה בזמן אמת.

Protocol

1. הדמיה

1. ביום הניסוי, הפעל את מערכת המיקרוסקופ. הפעל את תוכנת ההדמיה (ראה טבלת חומרים) על ידי לחיצה על האייקון המתאים בשולחן העבודה. אתחול את המיקרוסקופ על ידי לחיצה על אפשרות אתחול מיקרוסקופ (הכפתור המוצג עם מיקרוסקופ עליו) בתיבת הדו-שיח של ההפעלה של התוכנה. ודאו שהמטרת מורדת במלואה באמצעות התכוונון גס במיקרוסקופ לפני האתחול.
   הערה: לאחר האתחול, צריכות להופיע שלוש תיבות דיאלוג נוספות בנוסף לתפריט ההתחלה: resolve3D, איסוף נתונים ומוניטור סינון.
2. יש להניח טיפה של שמן של 1.517 (מקדם שבירות) על מטרה לטבילה פי 100 שסופקה על ידי היצרן (פתח מספרי = 1.4, מרחק עבודה = 0.12 מ"מ; ראו טבלת חומרים).
   הערה: חשוב לבחור את שמן הטבילה המתאים לטמפרטורה שבה מתבצעת ההדמיה.
3. טען את צלחת הזכוכית המכילה את הדגימה לתוך מארז המתכת (הארון) והחליק בעדינות לתוך מהדק הבמה.
4. השתמש בכפתור הכיוון הגס כדי להרים את האובייקטיב עד שהשמן נוגע בתחתית הזכוכית של הצלחת. השתמש בעינית ובכפתור הכיוון הדק כדי להבליט את הדגימה בפוקוס. לאחר שהתאים בפוקוס, סובבו את הכפתור מהעינית למצב מצלמה על ידי הזזת מתג הבחירה הממוקם בחזית גוף המיקרוסקופ שמאלה.
5. התחל את הניסוי באמצעות תוכנת ההדמיה. בחלון resolve3D , בחר את סמל הניסוי Design/run שמוצג על ידי בקבוק. תיבת דו-שיח חדשה אמורה להופיע בשם design/run experiment.
   1. הגדר את מספר ערימות ה-Z ועובי הדגימה באמצעות העיצוב ואז לשונית החתך בתיבת הדו-שיח של ניסוי עיצוב/הרצה .
      הערה: לניסויים בחלק התוצאות המייצגות, השתמשו ב-17 ערימות Z במרווח של 200 ננומטר לתמונות סטילס וארבע מחסניות Z במרווח 200 ננומטר למיקרוסקופיית טיימ-לאפס.
   2. כדי למדוד את עובי התאים בדגימה, כוונן ידנית את מישור ה-Z בהדרגה באמצעות החצים למעלה ולמטה בתיבת הדו-שיח resolve3D . סמן את המקום שבו התאים יוצאים מהמיקוד כגבולות העליונים והתחתונים לרכישת תמונה. ייבא את המידע הזה לפני ביצוע הניסוי.
   3. כדי לסייע במזער פוטוטוקסיות והלבנת פוטו-ליצ'ינג במהלך הדמיית טיימ-לאפס, הפחיתו את מספר ערימות ה-Z ובחרו את המישור האמצעי של התאים לרכישת תמונה.
6. בחר את מערך המסננים המתאים לניסוי באמצעות העיצוב ואז לשונית הערוצים בתיבת הדו-שיח של עיצוב/הרצת ניסוי (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
   1. כמו כן, בחר הפניה לאיסוף מידע POL/DIC. כוונן את אחוז השידור (עוצמת האור) ומשך החשיפה עבור ערוצים בודדים שנבחרו לפני ההדמיה על ידי בחירת האפשרויות המתאימות בתיבת הדו-שיח resolve3D .
      הערה: בשדה ראייה לבדיקה שאינו נלקח בחשבון לניסוי, יש לבדוק את ההגדרות הללו כדי לזהות אם הפרמטרים הנבחרים מקבלים נתוני פלואורסצנציה משמעותיים מבלי לפספס אות חלש או לרוויה עליו. ואז ייבא את הפרמטרים האלה להגדרת הניסוי.
7. פתח את רשימת הנקודות על ידי בחירת כפתור רשימת הנקודות בתיבת הדו-שיח resolve3D . תיבת דו-שיח חדשה אמורה להופיע בשם רשימת נקודות. סמן מספר שדות ראייה לשימוש בניסוי על ידי מציאת שדות ראייה מתאימים באמצעות בקרות שלב המיקרוסקופ ובחירת אפשרות סימון נקודות בתיבת הדו-שיח של רשימת הנקודות.
   הערה: יש לבחור נקודת החלפה בכל פעם שהמיקרוסקופ ממוקד מחדש בנקודה ברשימת הנקודות. ניתן לעשות זאת על ידי מיקוד המיקרוסקופ בנקודה המתאימה ברשימה ואז בחירת כפתור נקודת ההחלפה . חשוב לא לגעת בכפתור הכוונון האנלוגי/הדק בעת מיקוד מחדש; תשתמש רק בתוכנה כדי לכוון את הפוקוס.
8. הגדר פרמטרים של טיימלפס על ידי בחירת העיצוב ואז לשונית ה-timelapse בתיבת הדו-שיח של הניסוי/הפעלה. בחר בתיבת הסימון של טיים-לאפס. הזן את פרמטרי הטיימ-לאפס המתאימים במונחים של תמונות טיים-לאפס/סך הזמן.
9. הגדר נקודות להדמיה מתוך רשימת הנקודות על ידי בחירת העיצוב ואז לשונית הנקודות בתיבת הדו-שיח של עיצוב/הרצת ניסוי. בחר באפשרות רשימת נקודות ביקור והזן נקודות לתמונה בתיבת הטקסט המופרדת בפסיקים או מקפים אם מדובר ברצף שלם.
10. לפני תחילת הניסוי, ערוך שמות קבצים ומיקומי קבצים באמצעות לשונית הרצה בתיבת הדו-שיח של design/run. ניתן לשנות את מיקום הקובץ על ידי בחירת כפתור ההגדרות , בחירת תיקיית הנתונים, ואז בחירת התיקייה המתאימה או יצירת תיקייה חדשה. שנה את שמות הקבצים על ידי הזנת שם הקובץ החדש בתיבת הטקסט של שם קובץ התמונה.
11. התחל את הניסוי על ידי בחירת כפתור ההפעלה בתיבת הדו-שיח של תחילת הניסוי .
    הערה: לגבי טיים-לפס, בדוק באופן רציף פוקוס בכל שדה ראייה לאורך כל הניסוי באמצעות הגדרת DIC (כדי למנוע פוטובלינינג מיותר) ומקדש מחדש ועדכון המידע ברשימת הנקודות כי התאים נוטים לצאת מהפוקוס עם הזמן.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אגרוז	פישר ביוריאגנטים	BP160-100	ציון ביולוגיה מולקולרית - EEO נמוך
FM4-64	Invitrogen	T3166	מיקרוסקופיה
צלחת תחתית זכוכית	MatTek	P35G-1.5-14-C	מיקרוסקופיה
מיקרוסקופ	GE	דלתה-ויז'ן אליט	מעמד מיקרוסקופ הפוך מותאם אישית של Olympus IX-71; מגדל תאורה מותאם אישית ומודול תאורה משודרת. מטרות: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 מ"מ); שמן אולימפי 100X (1.4, משקל 0.12 מ"מ); DIC Prism Nomarski ל-100X Objective; מצלמת CoolSnap HQ2; SSI Assembly 7-color; תא בקרה סביבתית - אטום.
PC190723	מיליפורסיגמא	3445805MG	מעכב FtsZ
סופטוורקס	GE		תוכנת הדמיה שסופקה על ידי היצרן