$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים המוסדית המקומית וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. חיסון ליסטריה מונוציטוגנס בעכברים באמצעות הזרקת וריד זנב והערכת עומס חיידקים בכבד, בטחול ובלב
הערה: כל עבודת בעלי החיים מתבצעת בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית רמה 2 של ה-CDC. עכברים בדרך כלל מזמינים שבוע מראש ונכלאים יחד עם 5 בעלי חיים בכל כלוב. העכברים מורשים להסתגל לסביבה החדשה של מעבדה במשך ארבעה ימים לפני ההזרקה. ניסויים אלו השתמשו בנקבות עכברי שוויצרי-וובסטר בגילאי 6-8 שבועות, שהוחזקו 5 עכברים בכלוב בסביבה מחסום והוזנו בתזונה לא מוגבלת.
- הכינו כלוב אחד של עכברים בכל פעם על ידי הסרת המכסה ומיכלי האוכל/מים, והנחת הכלוב מתחת למנורת חימום למשך חמש דקות. תהליך זה מאפשר לורידים הזנביים להתרחב, מה שמקל על ביצוע ההזרקות.
- הוציאו חיה אחת והניחו אותה ברתמה (או צינור בז עם קצה חתוך) כדי לרסן אותה במהלך ההזרקה.
- נקה את אתר ההזרקה באמצעות רפידת אלכוהול, ותן לאלכוהול להתאדה. זה לא רק מנקה את המקום, אלא גם מרחיב עוד יותר את וריד הזנב.
- באמצעות מזרק של 1 מ"ל המצויד במחט 27.5 גייג', הזריק בעכבר בעדינות 200 מיקרול מהתרבית הרצויה לתוך וריד הזנב.
- השתמשו בגזה כדי לעצור כל דימום שעשוי להתרחש כתוצאה מהזריקה, והניחו את החיה בכלוב חדש.
- חזור על התהליך הזה עבור בעלי החיים והזנים שנותרו. ודאו לסמן כל כלוב בעלי חיים בזן שהוא קיבל.
- בדקו את החיות מדי יום, הסרו והקריבו כל חיה שנראית חולה. אם אף בעלי חיים לא מראים סימני מחלה, אפשר לזיהומים להימשך 72 שעות לפני הקרבת כל בעלי החיים.
- כדי להקריב, השתמש בהרדמה CO2 ממקור בבקבוק עד שכל הנשימות נעצרות, ואז השתמש בפריקה צווארית כדי לוודא שהחיה מתה.
- לאחר ההקרבה, העבר את החיות לכיסוי תרבית רקמות לניתוח.
- באמצעות בלוק חיתול, דקר כל רגל של החיה עם מחטים גדולות וריסס אותה ב-70% אתנול עד שהיא רוויה.
- חתכו את עור הבטן והחזה לאחור באמצעות חתך בצורת Y שממשיך מהפתח הנרתיק ועד לתהליך הזיפואיד, וממשיך משם אל בית השחי של כל זרוע.
- משכו את העור לאחור והסירו את המחטים מכל רגל כדי להחזיק את הדיסקציה פתוחה.
- חתכו בעדינות דרך הפריטונאום, חושפים את המעיים, הקיבה, הכבד והטחול.
- על ידי חיתוך הווריד הכבדי והרצועה הקורונלית בחלק העליון של הכבד, התחל להסיר את הכבד. רצועות נוספות שיש להסיר נמצאות מתחת לכבד, ומחברות אותו לחלק הראשון של המעי הדק, וכן לשרירי הגב.
- שים את הכבד ב-5 מ"ל של ddH2.0סטרילי בצינור פלקון בנפח 50 מ"ל.
- לאחר מכן, הסרת הטחול על ידי בידוד וחיתוך עדין של כלי הדם והרצועות. הטחול יוסר בקלות רבה יותר מהכבד. הניחו את הטחול בצינור נץ נפרד המכיל 5 מ"ל סטרילי ddH20.
- אתר את הסרעפת וחתוך בעדינות לאורך כלוב הצלעות כדי לדמיין את החזה. חותכים דרך תהליך הזקפואיד והסטרנום לגובה הצוואר כדי לפתוח את החזה, ולחשוף את הלב והריאות.
- באמצעות מלקחיים, תפסו בעדינות את הלב מהקצה שלו, והרימו אותו כך שהאאורטה וכלי הדם הריאתיים יהיו במתח. חתוך את כלי הדם האלה כדי לשחרר את הלב.
- הכניסו את הלב לצינור בז בנפח 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של DDH20 סטרילי.
- השליכו את גופת העכבר, וחזרו על התהליך לכל חיה, באמצעות צינורות נץ נקיים המכילים 5 מ"ל DDH2.0סטרילי עבור כל איבר שהוסר.
- לאחר שכל האיברים הוסרו, נקה את תחנת העבודה וחזרה לספסל.
- הכן סט של 5 צינורות לשימוש בניקוי ועיקור ההומוגניזר עבור כל סט איברים מחמישה עכברים (למשל סט 5 צינורות ל-5 כבדים, 5 צינורות ל-5 טחולים, ו-5 צינורות ל-5 לבבות). ארבעה מכל צינור צריך להיות מלא ב-30 מ"ל סטרילי ddH20, ואחד צריך להיות מלא ב-30 מ"ל 90% EtOH.
- באמצעות TissueMaster (או הומוגנייזר מקביל), טבל את ההומוגניזר (תוך כדי הפעלה) בצינורות שהוכנו בשלב 1.21 לניקוי הגשוש:
- צינור 1 (ddH2O) 5 שניות בצינור 2 (ddH2O) 5 שניות בצינור 3 (EtOH) 5 שניות בצינור 4 (ddH2O) 5 שניות בצינור 5 (ddH2O)
- הומוגניזציה של כבד אחד באמצעות ההומוגניזר לפחות ל-2 דקות, או עד שלא יישארו חלקים נראים לעין מהאיבר. השתמש בפינצטה כדי להסיר כל פסולת גדולה מהגשש.
- חזור על תהליך הניקוי שתואר.
- חזור על תהליך ההומוגניזציה עבור שאר הכבדים, וודא שאתה שוטף את הגשוש בין כל כבד לפי התהליך שתואר.
- לאחר שכל הכבדים הומוגניים לחלוטין, השליכו את צינורות הכביסה (1-5) של הכבד.
- חזור על תהליך ההומוגניזציה/ניקוי גם לטחול וגם ללב, תוך הקפדה להשתמש בסט חדש של צינורות שטיפה לכל סדרת איברים. אם בשלב כלשהו צינורות הכביסה הופכים לעכורים, זרקו אותם והחליפו בצינורות חדשים כדי לסיים את הסדרה.
- אחרי שכל האיברים הומוגניים, בצע מחזור ניקוי אחרון על ההומוגניזר וייבש אותו היטב לאחסון.
- הניחו כ-200 מיקרוליטר מכל איבר בתוך באר נפרדת עם לוח בעל 96 בארות.
- לבצע דילול סדרתי על דגימות האיבר על ידי דילול של 1:10 בסדרה עד דילול של 1:10,000 (כבד וטחול) או עד דילול של 1:1,000 (לב).
- הנח את סדרת הדילול על אגר LB מחומם מראש. הסר גם 20 אולר מכל איבר ולוח לא מדולל על לוחות אגר LB נפרדים כדי למנות את ה-CFU מאיברים שהתיישבו בצורה לקויה.
- השליכו את צינורות הפלקון המכילים את האיברים ההומוגניים, ועטפו את לוחות 96 הבארים המכילים את סדרת הדילול בפארפילם והניחו אותם בקופסת הקפאה בטמפרטורה של -80°C.
- תן לכתמים להתייבש. תהליך זה מואץ על ידי הנחת הלוחות במכסה המנוע והסרת המכסים.
- לאחר שהכתמים התייבשו, הניחו את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ללילה.
- ספרו את מספר המושבות בכל נקודה בבוקר שלמחרת והשתמשו בסדרת הדילול כדי לחשב את סך כל החיידקים באיבר.