$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים דגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הבחינה האתית המתאימה לבעלי חיים.
1. זיהום
- רכוש עכברי BALB/c משני המינים בגילאי 10-12 שבועות.
הערה: זן הסרוטיפ 4 של Streptococcus pneumoniae בשם TIGR4 הוא איזולוד קליני אלימי שעבר רצף. - גידול TIGR4 במרק טוד-היואיט בטמפרטורה של 37°C ב-5%CO2 עד להגיע לצפיפות אופטית (OD)620 של 0.5 (תואם ל-1.0 x10 8 יחידות ליצירת מושבות [CFU]/ml). הפלטה את תרבית הפנאומוקוק בצנטריפוגה למשך 10 דקות בעוצמה של 3,500 x גרם והסרת הסופרנטנט באמצעות קו ואקום. השעה ומדלל חיידקים עם מלח סטרילי מפופר-פוספט (PBS) לריכוז סופי של 1.0 x 104 CFU/ml.
- באמצעות תא השראה, הרדימו עכברים עם 2.5% איזופלוראן מאודה בחמצן. אשר מצב הרדמה על ידי צביטה עדינה באצבע עם פינצטה קהה.
- מחזיקים את העכבר המורדם בעורפו ועומד ביד אחת, והזרקו לכל עכבר תוך-פריטונית (i.p.) 100 מיקרוליטר של תליית S. pneumoniae באמצעות מזרק עם מחט 27-30 (תואמת למינון אתגר של 1.0 x 103 CFU). תחזיר את העכבר לכלוב. עכברים בדרך כלל מתעוררים 30-40 שניות לאחר ההזרקה.
- אפשר לזיהום להימשך לפחות 24 שעות (מוקדמות) או 30 (מתקדמות).
- הרס את העכברים באמצעות חנקCO2 . בצע ניתוק צוואר הרחם כדי לוודא שהעכבר מת. המתת חסד מאושרת עוד יותר על ידי הסרת הלב בשלב 1.6.
- חטא את הזנב עם מטוש אלכוהול וגוזם קטע בגודל 2-3 מ"מ. אספו 2 מיקרוליטר דם ומדללים את הדם פי 10 ב-PBS המכיל סודיום הפארין 1 U/ml חמש פעמים. דילול סדרתי של הלוחות על צלחת אגר דם סויה טריפטית ודגירה במהלך הלילה בטמפרטורה של 37°C ב-5%CO2. למחרת, מסקנים מהמושבה סופרים את רמת הבקטרמיה.
- השבית את העכבר במצב שכיבה על הגב על פלטפורמת ניתוח. רסס את החזה ב-70% אתנול וייבש בעדינות את זה. באמצעות מספריים כירורגיים ומלקחיים, פתחו את חלל החזה, הסרו את כלוב הצלעות וחתכו את הסרעפת כדי לחשוף את הלב והריאות. באמצעות מספריים, חתכו את כלי הדם המחוברים ללב וחצו בעדינות את הלב בזהירות כדי למנוע חבורות במלקחיים.
- שטוף את הלב עם PBS ואז הכניסו אותו לקלטות איסוף דגימות רקמה כך שיתקבלו חתכים קורונליים במהלך חתך הרקמה. להטמעת פרפין, שים את הקסטות בתמיסת פורמלין עם 10% בבופר, ולמחרת שלח להטמעת פרפין.
- חלופה נוספת היא הקפאה בזק באמצעות תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T.) בתוך קריומולד שהונח על קרח יבש.
2. הדמיה של נגעים לבביים ופנאומוקוקים בתוך נגעים
- חתוך את חלקי הלב המוטמעים בפרפין כך שארבעת התאים של הלב יהיו גלויים בכל חתך רקמה. חותכים מחסניות בעובי של 5 מיקרון.
- דה-פרפין וצבע סליידס עם המטוקסילין ואאוזין (H&E) בשיטות סטנדרטיות.
- צפו בחתכי לב מוצבעים ב-H&E באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלות נמוכות (100X, 200X) וגבוהות (טבילה בשמן: 400X, 1,000X). אפיין לבבות לנוכחות מיקרו-נגעים בשריר הלב. כאן, ניתן לרכוש תמונות H&E באמצעות מיקרוסקופ Zeiss Axioskop 2 המצויד במטרה Plan-NEOFLUAR בגודל 100X 1.3 בצמצם נומרי.
הערה: בשלבים מוקדמים, נגעים לבביים מובחנים לפי מראה צבעי שונה ובמקרים מסוימים נוכחות תאי חיסון (מונוציטים וגרנולוציטים), שנראים כמונוציטים. בנגעים מתקדמים, במיוחד אלו שנראים לאחר 30 שעות, תאי החיסון נעדרים, ובמקומם נצפים נגעים גדולים דמויי ואקואולה. חשוב לציין שלמרות שזרימת תאי מערכת החיסון בשלבים המוקדמים של התפתחות נגע לבבי יכולה להתרחש, נראה שזה לא דרישה.