$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים דגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הבחינה האתית המתאימה לבעלי חיים.
1. זיהום
- רכוש עכברי BALB/c משני המינים בגילאי 10-12 שבועות.
הערה: זן הסרוטיפ 4 של Streptococcus pneumoniae בשם TIGR4 הוא מבודד קליני אלים שעבר ריצוף. - גדלו TIGR4 במרק טוד-היואיט בטמפרטורה של 37°C ב-5%CO2 עד שהתרבית מגיעה לצפיפות אופטית של 620 ננומטר (OD620) של 0.5 (המקביל ל-1.0 ×10 8 יחידות יוצרות מושבות [CFU]/ml). הפלטה את תרבית הפנאומוקוק בצנטריפוגציה במשך 10 דקות ב-3,500 × גרם והסרת הסופרנטנט באמצעות קו ואקום. השעה ומדלל חיידקים עם מלח סטרילי מפוזר-פוספט (PBS) לריכוז סופי של 1.0 × 104 CFU/ml.
- באמצעות תא השראה, הרדימו עכברים עם 2.5% איזופלוראן מאודה בחמצן. אשר מצב הרדמה על ידי צביטה עדינה באצבע עם פינצטה קהה.
- מחזיקים את העכבר המורדם בעקיפתו ועומד ביד אחת, והזרקו לכל עכבר תוך-פריטונית (i.p.) 100 מיקרוליטר של תליית S. pneumoniae באמצעות מזרק עם מחט 27-30 גייג' (המקביל למינון אתגר של 1.0 × 103 CFU). תחזיר את העכבר לכלוב. עכברים בדרך כלל מתעוררים 30-40 שניות לאחר ההזרקה.
- אפשר לזיהום להימשך לפחות 24 שעות (מוקדמות) או 30 (מתקדמות).
- המית את העכברים באמצעות חנק CO2. בצע ניתוק צוואר הרחם כדי לוודא שהעכבר מת. המתת חסד מאושרת עוד יותר על ידי הסרת הלב בשלב 1.6.
- חטא את הזנב עם מטוש אלכוהול וגוזם קטע בגודל 2-3 מ"מ. אספו 2 מיקרוליטר דם ומדללים את הדם פי 10 ב-PBS המכיל סודיום הפארין 1 U/ml חמש פעמים. דילול סדרתי של הלוחות על צלחת אגר דם סויה טריפטית ודגירה במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2. למחרת, מסקנים מהמושבה סופרים את רמת הבקטרמיה.
- השבית את העכבר במצב שכיבה על הגב על פלטפורמת ניתוח. רסס את החזה ב-70% אתנול וייבש בעדינות את זה. באמצעות מספריים כירורגיים ומלקחיים, פתחו את חלל החזה, הסרו את כלוב הצלעות וחתכו את הסרעפת כדי לחשוף את הלב והריאות. באמצעות מספריים, חתכו את כלי הדם המחוברים ללב וחצו בעדינות את הלב בזהירות כדי למנוע חבורות במלקחיים.
- שטוף את הלב עם PBS ואז הכניסו אותו לקלטות איסוף דגימות רקמה כך שיתקבלו חתכים קורונליים במהלך חתך הרקמה. להטמעת פרפין, שים את הקסטות בתמיסת פורמלין עם 10% בבופר, ולמחרת שלח להטמעת פרפין.
- לחלופין, הקפאת פלאש באמצעות טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T.) תרכובת בתוך קריומולד שהונח על קרח יבש.
2. הדמיה של נגעים לבביים ופנאומוקוקים בתוך נגעים
- חתוך את חלקי הלב המוטמעים בפרפין כך שארבעת התאים של הלב יהיו גלויים בכל חתך רקמה. חותכים מחסניות בעובי של 5 מיקרון.
- דה-פרפין וצבע סליידס עם המטוקסילין ואאוזין (H&E) בשיטות סטנדרטיות.
- צפו בקטעי לב מוצבעים ב-H&E באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלות נמוכות (100×, 200×) וגבוהות (טבילה בשמן: 400×, 1,000×). אפיין לבבות לנוכחות מיקרו-נגעים בשריר הלב. כאן, ניתן לצלם תמונות H&E באמצעות מיקרוסקופ Zeiss Axioskop 2 המצויד במטרת Plan-NEOFLUAR בגודל 100× 1.3 צמצם נומרי.
הערה: בשלבים מוקדמים, נגעים לבביים מובחנים לפי מראה הצבע השונה שלהם ובמקרים מסוימים גם על נוכחות תאי חיסון (מונוציטים וגרנולוציטים), שנראים כמונוציטים. בנגעים מתקדמים, במיוחד אלו שנראים לאחר 30 שעות, תאי החיסון נעדרים, ובמקומם נצפים נגעים גדולים דמויי ואקואולה. חשוב לציין שלמרות שזרימת תאי מערכת החיסון בשלבים המוקדמים של התפתחות נגע לבבי יכולה להתרחש, נראה שזה לא דרישה.
3. מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית לפנאומוקוקים בתוך מיקרו-נגעים
- חתך את הלב ב-cryomolds עם מיקרוטום בעובי 5 מיקרון והנח חתכים על מחסניות זכוכית טעונות חיובית. אפשר לחלקי לב קפואים להפשיר ולהתייבש באוויר. תקן חתכים ל-10 דקות בפורמלין ניטרלי עם 10% בופר (pH 6.8-7.2 ב-25 מעלות צלזיוס).
- שטוף שקופיות (3×) ב-PBS למשך 5 דקות, פרמייביליז ל-15 דקות ב-0.2% Triton X-100 ב-PBS, ואז שטוף שוב ב-PBS.
- חסימת חתך רקמה על שקופיות עם סרום עזים 10% ב-PBS למשך שעה.
- שטוף שקופים עם PBS, כסה ודגר חלקי לב עם אנטיסרום אנטי-סרוטיפ ארנב 4 pneumococcus ב-1:1,000 ב-PBS עם 10% סרום עזים למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.
הערה: לביקורת שלילית, החוקרים צריכים להשתמש באנטיסרום ארנב נאיבי - לאחר שטיפה עם PBS, כיסו ודגרו קטעים עם 10% סרום עזים-PBS עם נוגדן קונוגט אנטי-ארנב פלואורסאין איזותיוציאנאט (FITC) בטמפרטורה של 1:2,000 למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
- בהתאם להוראת היצרן, השתמשו ב-DAPI (4',6- דיאמידינו-2-פנילינדול) במינון 5 מ"ג/מ"ל להמחשת גרעיני האאוקריוטיים. שטוף והתקן חתכי רקמה עם FluorSave.
- לצלם תמונות פלואורסצנטיות באמצעות מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי בהגדלה נמוכה וגבוהה כאחד. כוונן את הצמצם המספרי בהתאם כדי לקבל תוצאות מיטביות. כאן, ניתן לרכוש תמונות פלואורסצנטיות באמצעות מערכת קונפוקלית עם מטרה מספרית של 60× 1.42.