זיהוי מבוסס PCR של פתוגנים המועברים במזון מדגימות זבובים מועשרות

תקציר

מקור: Pava-Ripoll ואחרים. זיהוי פתוגנים חיידקיים המועברים במזון מזבובי לכלוך בודדים. J. Vis. Exp. (2015)

הסרטון הזה מדגים שיטה מבוססת PCR שמגבירה DNA חיידקי מטרה מדגימות זבובים מועשרות באמצעות טבליות ייחודיות לפתוגן, ומאפשרת זיהוי פלואורסצנציה בזמן אמת וניתוח עקומת התכה לאישור נוכחות פתוגנים המועברים במזון בחרקים בודדים.

פרוטוקול

1. Hydrate PCR (תגובת שרשרת פולימראז) - טבליות מוכנות

1. בחר בלוק קירור PCR מקורר (4 מעלות צלזיוס) והניח מתקן צינור PCR מעל ההכנסה.
2. הניחו את צינורות ה-PCR המתאימות המכילים את הטבליות המוכנות ל-PCR (הכלולות עם כל ערכה) עבור הפתוגן המועט במזון, בהתאם לקובץ המדף.
3. באמצעות כלי הניקוי, הסר בזהירות את הפקקים מצינורות PCR. השליכו את הפקקים וודאו שכל שפופרת מכילה טאבלט.
4. העבר 50 מיקרוליטר (עבור סלמונלה וקרונובקטר) או 30 מיקרוליטר (עבור L. monocytogenes) של ליזאט לצינורות PCR ספציפיים. השתמש בקבלים אופטיים חדשים וקבע אותם היטב על צינורות ה-PCR באמצעות כלי המכסה.
   הערה: לאחר הוספת הליזאט לטבליות מוכנות ל-PCR, יש לשמור דגימות מקוררות בטמפרטורה של 2 - 8 מעלות צלזיוס עד להטענה למערכת הזיהוי מבוססת PCR. ניתן לצנטריפוג את צינורות ה-PCR בעוצמה של 2,500 x g למספר שניות כדי להבטיח שהנפח המלא נמצא בתחתית הצינור.
5. טעין את שפופרות ה-PCR למכשיר מערכת הסייקלר/מערכת הזיהוי של ה-PCR על ידי פתיחת מגירת המכשירים.
6. הכניסו את מתקן צינורות ה-PCR לבארות שבמגירה ובדוק שהצינורות יושבים כראוי.
7. סגור את המגירה והתחל את התוכנית כפי שמתואר בפרוטוקול היצרן.
   הערה: המכשיר המבוסס על PCR כולל פרמטרי מחזור מוגדרים מראש לכל פתוגן שמועבר במזון.
8. ודאו שפס הסטטוס של מחזור ה-PCR מציג פס כחול שמצביע על כך שחלק ההגברה של התוכנית פועל.
   הערה: בבדיקות PCR סטנדרטיות, זמן העיבוד של כל התוכנית (הגברה וזיהוי) לוקח כ-3 עד 3.5 שעות להשלמה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כלי הכיסוי	דופונט	D11677028
כלי ניקוי	דופונט	D11134095
מתקן/מחזיק צינור PCR	דופונט	D12701663
קצה דק, מלקחיים עם קצה ישר	BioQuip	4731	לחטא לפני השימוש. מספר ספקים.
בלוק קירור			מספר ספקים.
צנטריפוגה			מספר ספקים.