בדיקה מהירה מבוססת תמונה לסינון אלימות חיידקית הנגרמת על פני שטח

תקציר

מקור: פרינבם, ק., וסיריאפורן, א. בדיקת אלימות חיידקית מהירה מבוססת תמונה באמצעות אמבה. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים שיטה מהירה מבוססת תמונה להערכת אלימות חיידקים על ידי דגירה של אמבות עם חיידקים מחוברים למשטחים או פלנקטוניים, יישום פד אגרוז קלציין-אצטוקסיתיל (calcein-AM), ודימות פלואורסצנציה לזיהוי נזק לתאי המארח.

פרוטוקול

1. מיקרוסקופיה - הכנת משטח האגר

1. הכינו כריות אגר כ-30 דקות עד שעה לפני שהאמבות מוכנות לערבוב עם Pseudomonas aeruginosa.
2. מיקרוגל 50 מ"ל של 1% אגר (w/v) בבופר פיתוח (DB) בבקבוק של 250 מ"ל. מערבבים כל 20 שניות עד שגושי האגר נעלמים.
3. קיררו את האגר המותך על ידי הנחתו באמבט מים מחומם מראש בטמפרטורה של 55°C למשך 15 דקות.
4. הוסף 15 מיקרוליטר מתמיסת המאגר הקלצין-AM ל-15 מ"ל של האגר המותך בצינור קוני. ערבב על ידי הפיכת הצינור בעדינות 4-5 פעמים, וממשיך מיד לשלב הבא.
   הערה: בצע את השלב הזה בצינור צנטריפוגה פוליפרופילן בנפח 15 מ"ל. אל תשתמשו במיכל זכוכית עבה, כי זה יגרום לאגר להתקשות מהר מדי.
5. שפכו את תערובת האגר המותכת מעל צלחת זכוכית בגודל 12 ס"מ על 10 ס"מ ותנו לאגר להתקשה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. חתוך את כרית האגר המוצקה לחלקים קטנים יותר בגודל 1.5 ס"מ על 1.5 ס"מ על ידי הנחת לוח הזכוכית מעל רשת מודפסת וחיתוך לאורך הרשת באמצעות סרגל מתכתי.
6. שמור על הג'ל לחים בקופסה לחה עד שהוא מוכן לשימוש.

2. מיקרוסקופיה - הכנת דגימת החיידקים-אמבה להדמיה

1. כדי לבדוק את האלימות של תאי חיידקים מחוברים למשטח, הוסף 10 מיקרוליטר של תאי אמבה לחיידקים המחוברים למשטח.
   הערה: שלב זה מתאר את ערבוב האמבות עם חיידקים.
2. כדי לבדוק את אלימות תאי הפלנקטוניים, ערבבו 10 מיקרוליטר של תאי אמבה עם 10 מיקרוליטר של חיידקים פלנקטוניים.
   הערה: אין לשטוף את תאי האמבה שגדלו באקסניה (ב-OD₆₀₀ של 0.2 עד 0.5) לפני ההתערבבות עם החיידקים. לא תצפה גדילה של E. coli בתרבות האמבה עקב השימוש בתמיסת אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית.
3. מיד הניחו את כרית האגר של קלציין-AM בגודל 1.5 ס"מ על 1.5 ס"מ משלב 1.5 על תערובת החיידקים-אמבה על משטח צלחת פטרי.
   הערה: הנח את כרית האגר מעל התערובת בתנועה מהירה וחלקה. אל תוריד את הכרית לאט על התערובת, שכן תנועה זו נוטה לדחוף את התאים לעבר ההיקף ולהתרחק מתחת לרפוד. שלב זה יבטיח שהחיידקים והאמבות מעורבבים באופן שווה, משתקים, וששני סוגי התאים מוגבלים לאותו מישור.
4. הסר נוזלים עודפים על ידי פיפיפט עדין של כל נוזל שנותר סביב כרית האגר. תן לצלחת פטרי להתייבש 20 דקות בטמפרטורת החדר.
5. כסו את צלחת הפטרי במכסה ודגרו את תערובת האמבה-חיידקים המשותקת בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות נוספות. המשך לשלב 3.1.
   הערה: חשוב לדגור את כל הדגימות לאותו פרק זמן, שכן הפלואורסצנציה ברקע עולה עם הזמן. מומלץ זמן דגירה של שעה. דגירות שנמשכות יותר משעה פחות ניתנות לשכפול כאשר תאי האמבות עלולים להתחיל להתפוצץ.

3. מיקרוסקופיה - רכישת תמונות

1. אמבות תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה המסוגל לצלם תמונות פלואורסצנציה בהירות וירוקות. לפלואורסצנציה ירוקה, השתמשו במסנני חלבון פלואורסצנציה ירוקים (GFP) עם 474/27 ננומטר ו-525/45 ננומטר לגירוי ופליטה, בהתאמה. השתמשו באובייקטיב 10X (≥0.3 נקודה מספרית) כדי לצלם את האמבות.
   הערה: הקלצין-AM באגר יגרום לאמבות גוססות לזהור בערוץ הפלואורסצנציה הירוק. אמבות בריאות אינן פלואורסצנטיות.
2. כוונן את זמני הרכישה עבור ניגודיות פאזה, ערוצי GFP להגבלת פוטוטוקסיות ואופטימיזציה של טווח הדינמי של עוצמות התמונה. אם יש צורך להחליף את ניגודיות הפאזה של הפרעות דיפרנציאליות (DIC).
   הערה: השתמש בחשיפות של 100-200 מילישניות לניגוד פאזה ופלואורסצנציה GFP אם אפשר. תשמור על החשיפה והגדרות הכלים ללא שינוי לאורך כל הניסוי. זה קריטי לחישוב מדד הריגת המארח.
3. לרכוש תמונות לפחות ל-100 תאי אמבה כדי לקבל סטטיסטיקות טובות לחישוב מדד השמדת המארח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים
אגר בקטו, מיובש	BD Difco	214010
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (100X)	טכנולוגיות חיים	15240062	Aliquot < 1 מ"ל ואחסון ב-20°C-
אסטר קלציאן-אצטוקסיתיל (קלסין-AM)	טכנולוגיות חיים	C34852	קלסין אצטוקסימתיל (AM)
כלוריד סידן, חסר מים	סיגמא-אלדריץ'	C1016
D-גלוקוז	פישר כימיקל	D16500	דקסטרוז
דימתיל סולפוקסיד	סיגמא-אלדריץ'	D5879
חומצה פולית	סיגמא-אלדריץ'	F8758
LB-מילר	BD Difco	244620
כלוריד מגנזיום	סיגמא-אלדריץ'	M8266
תמצית שמרים	אוקסואיד	LP0021
פפטון מיוחד	אוקסואיד	LP0072
אשלגן הירוקסיד	פישר כימיקל	P250
אסלגן פוספט מונובסיסי	סיגמא-אלדריץ'	P0662
נתרן פוספט די-בסיסי הפטהידרט	פישר כימיקל	S373
ויטמין B12	סיגמא-אלדריץ'	V2876
זנים
דיקטיוסטליום דיסקוידאום	מעבדת סיריאפורן	זן AX318
אשריכיה קולי	מעבדת סיריאפורן	זן B/r17
פסאודומונס אארוגינוסה	מעבדת סיריאפורן	PA14	זן PA14 19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	מעבדת סיריאפורן	AFS20.1	זן 20 שמקורו ב-PA14
אספקה
מסנן 0.22 מיקרון	מיליפור	SCGPT01RE	לצורך עיקור מסנן
צינור קוני, 15 מ"ל	קורנינג	352097
בקבוקי אחסון מזכוכית	פיירקס	13951L	250 מ"ל, 500 מ"ל, 1000 מ"ל
צלחת פטרי, קוטר 6 ס"מ	קורנינג	351007	לוחות פוליסטירן בגודל 60 x 15 מ"מ
צלחת פטרי, בקוטר 10 ס"מ	פישר	FB0875712	לוחות פוליסטירן בגודל 100 על 15 מ"מ
מיכלים מפלסטיק עם מכסה	זיפלוק	2.57E+09	מיכלים מרובעים של 3 כוסות
לוחות זכוכית	ביו-ראד	1653308	להכנת פדי אגר. לוחות זכוכית אחרים עשויים לשמש במידות דומות.
מקלות עץ	פישר	23-400-102
ציוד
מיקרוסקופ Eclipse Ti-E	ניקון	MEA53100	הגדרת מיקרוסקופ
תוכנית פלואור 10X מטרה 0.3 NA	ניקון	MRH20101	הגדרת מיקרוסקופ
מקור עירור פלואורסצנציה	לומנקור	מנוע קל סולה	הגדרת מיקרוסקופ
סט מסנני פלואורסצנציה	סמרוק	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	הגדרת מיקרוסקופ
מצלמת Orca Flash 4.0 V2	המאמאצו	77054098	הגדרת מיקרוסקופ
ImageJ	NIH	כרך 1.49	תוכנה לניתוח תמונות
MATLAB	מת'וורקס	R2013	תוכנה לניתוח תמונות
חממת רעידות אורביטלי	VWR	89032-092	לגידול חיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס
מנער פלטפורמה	פישר	13-687-700	לצמיחת אמבות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס
ספקטרופוטומטר	ביוכרום	אולטרוספק 10
חממה מקוררת מתחת לדלפק	פישר	97990E	לצמיחת אמבות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס
אמבט מים איזוטמפ	פישר	15-462-21Q	למדיית קירור עד 55 מעלות צלזיוס