הערכת עומס חיידקים בטחול העכבר לצורך מחקרי זיהום

תקציר

מקור: מדנספצ'ר, ג'. ה. ופסלר, מ. ב. שיטה לא פולשנית וטכנית לא אינטנסיבית לאינדוקציה ופנוטיפ של דלקת ריאות חיידקית ניסיונית בעכברים. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון הזה מדגים את תהליך כימות העומס החיידקי בטחול של עכבר נגוע כדי להעריך את חומרת ההדבקה. הטחול ההומוגני מדולל ומצופה באופן סדרתי כדי לקבוע את העומס הכולל של החיידקים. הנתונים שהתקבלו מספקים תובנות על אינטראקציות בין מארח לפתוגן בתוך רקמת מערכת הרכבת.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים המוסדית המקומית וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. שאיבת קנה הנשימה של Klebsiella pneumoniae בעכברו מהאורופרינקס

1. ודאו שהעכברים מזוהים באופן ייחודי לפי סימן זנב, קעקוע או מזהה מאושר אחר.
2. יש להכין חיסון מינון של חיידקים באמצעות פיפטת P200 לפני הסרת עכברים מהאיזופלוראן כדי לזרז את ההליך. לתוצאות מיטביות עם שאיפת מידע, השתמשו בנפח של <100 מיקרוליטר כדי למנוע הצפה. כאן, יש להשתמש ב-2000 יחידות ליצירת מושבות (CFU)/50 מיקרוליטר של K. pneumoniae.
3. הרדמו עכברים בתא שקוף עם גז איזופלוראן (למשל, 2% איזופלוראן בקצב זרימה של 1 ליטר לדקה) או לפי ההנחיות המוסדיות. מספר העכברים שיש להרדים יחד נקבע לפי רמת הנוחות של הנסוי, בדרך כלל 1-2 בכל פעם. תעקבו אחרי הנשימה ותוודאו את רמת ההרדמה ברגע שנשימות עמוקות נראות וניתן לספור 2-3 שניות בין הנשימות. הערה: אם יש חשש מהשפעות מבלבלות אפשריות של חומרי הרדמה נדיפים (שואפים), ניתן להשיג הרדמה במקום זאת באמצעות הזרקה תוך-פריטוניאלית של קטמין/זילאזין. בשיטה שתוארה לעיל, ההרדמה העמוקה נמשכת רק כמה דקות. אם מתבצעת הרדמה ממושכת יותר, יש להשתמש במשחת עיניים למניעת ייבוש עיניים.
4. לאחר שהעכבר מורדם, יש למקם אותו במצב שכיבה חצי-שוכבת, תלוי על ידי חותכות הלסת העליונה מגומייה המתוחה בין יתדות על לוח פלקסיגלס מוטה (איור 1).
5. משוך בעדינות את לשון העכבר הצידה עם זוג מלקחיים קהים וללא חרוצים, ומניח את המנה לחלל הפה עם פיפט P200. נהגו בזהירות רבה כדי למנוע טראומה ללשון או לאורופרינקס.
6. תוך שמירה על הלשון אחורה, חסמו בעדינות את האף עם אצבע עטויה בכפפה עד שהעכבר שואף. המשיכו לכסות את האף עד שהעכבר לקח שתי שאיפות או יותר, ואין נוזל נראה בחלל הפה. כיסוי האף מסייע להבטיח שהעכבר ינשום את החיידקים אל הריאות, שכן עכברים נושמים את האף באופן חובה.
7. הוציאו את העכבר מלוח החיסון וחזרו לכלוב, והניחו אותו על גבו כדי למנוע מצע או לכלוך לחסום את הנארים בזמן שהעכבר מתאושש מהרדמה.
8. לאחר שכל העכברים קיבלו מינון והתעוררו מהרדמה, עכברי הבית נמצאים בתא/חדר שמכיל רק עכברים שקיבלו מינון של K. pneumoniae. יש לעקוב אחרי עכברים מדי יום, כולל משקל גוף, אם הם עוברים יותר מ-48 שעות לאחר ההדבקה.
9. השתמש במאש יומי ו/או חום משלים אם מאפשרים לעכברים לעבור את 48 השעות.

2. קביעת עומס חיידקים ברקמות הריאה וההיקפיים

1. לפני שמתחילים: הכינו צינורות דילול עם 900 מיקרוליטר של 1x מלח בופר-פוספט (PBS) לריאות ולטחול ו-90 מיקרוליטר של 1x PBS לדם. לוחות תוויות לגידול חיידקים ומניחים בטמפרטורת החדר; לכן, לאחר איסוף הרקמה, הזמן בין ההומוגניזציה לציפוי לצמיחת חיידקים יוקטן למזער.
   הערה: עקב ההטרוגניות של הצטברות חיידקים בריאות שיכולה להתרחש בעקבות שאיבה, מומלץ להשתמש בעכברים בודדים לניתוח תאיות כוללת של דרכי הנשימה או עומס חיידקי ריאה כולל (דו-צדדי).
2. הורד עכברים לפי הנחיות מוסדיות. כאן, יש להשתמש בהזרקה קטלנית של 150 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל או מינון שווה ערך של תמיסת המתת חסד מסחרית, ואחריה הזרקת דם, שכן זה מונע סיבוכים אפשריים לריאות הקשורים לשאיפת_CO2 ופריקת צוואר הרחם.
3. הסר את הטחול והנח אותו לתוך 2 מ"ל של 1x PBS. שים צינורות על קרח. דאג לנקות כלים עם אתנול בין כל רקמה ועכבר.
4. הומוגניזציה של הרקמה על הקרח, רצוי עם הומוגנייזרים חד-פעמיים שניתן להחליף בין כל דגימה. קצוות הומוגניזר חד-פעמיים יכולים להיות מאוטוקלים לשימוש חוזר בין ניסויים.
5. לאחר שהרקמה הומוגנית, יש לבצע דילול סדרתי וצלחת. דגימות צלחת של רקמה/דילול נתון בכפיל על צלחת אגר סויה טריפטית (TSA) אחת על ידי ציור קו חלוקה על הפלסטיק. המלצות לציפוי ודילול מוצגות להלן (בכל המקרים, 10 מיקרוליטר דגימה מפוזרת על הצלחת) ומבוססות על נתיחה שנערכה 24 שעות לאחר ההדבקה. אם מנתחים דגימות של 48-72 שעות, ייתכן שיהיה צורך בציפוי מספר גדול יותר של דילול בשל עומס חיידקים מוגבר בנקודות זמן מאוחרות יותר
   1. לטחול - דילל ב-1:10-1:100 על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של טחול הומוגני ל-900 מיקרוליטר של PBS סטרילי 1x באופן סדרתי. הצלחת מסודרת והומוגנית ושתי הדילוליות בכפלה.
6. תן לדגימות הממרח להתייבש לזמן קצר.
7. הפוך את לוחות ה-TSA והנח בתנור סטטי של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
8. קבעו את מספר החיידקים המתיישבים על ידי ממוצע המושבות החיידקיים משני צידי הפלטה ומכל דילול. יש לקחת בחשבון את הדילול הראשוני של 5 מ"ל לריאה ו-2 מ"ל לטחול כדי לקבוע את סך כל ה-CFU ברקמה.

תוצאות

איור 1: לוח פרוצדורות לדלקת ריאות שאיבה בעכברים. עכברי המחקר ממוקמים, ראש מורם ואחורה ללוח (כלומר, חצי שוכב), תלויים על ידי החותכים מגומיי המתוח בין שני יתדות המותקנות על לוח פלקסיגלס או לוח דומה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ATCC	43816
בקטון דיקנסון	211825
הוכן פנימית	לא זמין	מים מזוקקים (5 ליטר), NaCl (40 גרם), KCl (1 גרם), Na₂HPO₄ (5.75 גרם), KH₂PO₄ (1 גרם)