המחשה של מטבוליטים של חומצות אמינו ברקמות המעי של עכברים נגועים

תקציר

מקור: Specker, J. T. ואחרים. חקירת שיתוף פעולה מיקרוביאלי באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסה של מושבות חיידקים שגדלו על אגר וברקמות במהלך זיהום. J. Vis. Exp. (2022)

הסרטון הזה מדגים את השימוש בספקטרומטריית מסה בלייזר בסיוע מטריצה (MALDI) כדי להמחיש את התפלגות חומצות האמינו ברקמות המעי של עכברים שנדבקו ב-Clostridioides difficile, לבד או בשילוב עם Enterococcus faecalis. ההליך כולל הכנת רקמות, יישום מטריצה, יינון לייזר וזיהוי יוני חומצות אמינו ליצירת תמונות יונים מרחביות. התוצאות חושפות שיתוף פעולה מיקרוביאלי, כאשר E. faecalis משנה את סביבת המעי על ידי שחרור אורניתין ודלול הארגינין, ובכך מגביר את הפתוגנזה של C. difficile .

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים המוסדית המקומית וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנה ומשלוח של רקמות בקרה לא נגועות, רקמות צהריים של עכברים שנדבקו ב-C. difficile
   1. החסן עכברים זכרים בני 4-8 שבועות C57BL/6 עם אנטיביוטיקה (0.5 מ"ג/מ"ל צפפראזון או 0.5 מ"ג/מ"ל צפופרזון + 1 מ"ג/מ"ל ונקומיצין) במי שתייה לפי רצונם למשך 5 ימים, לאחר מכן תקופת החלמה של יומיים והדבקה.
   2. הורד את בעלי החיים באמצעות חנק_CO2 וקצור מיד את איבר הסקום של העכבר. להטמיע בתערובת של 20% של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) במים מזוקקים.
   3. הנח את הדגימות על קרח יבש ואז ארוז ונשלח לניתוח; אחסן בטמפרטורה של מינוס 80°C עד לניתוח.

 

2. קריוסקטינג של רקמות ביקורת לא נגועות, לעומת רקמות צקל עכברי שנדבקו ב-C. difficile

1. נקה את כל ציוד הקריו-סקסיקציה על ידי שטיפה עם 100% אתנול ומתן לייבוש לפני הכנסת הדגימות לתא הקריוסטט. הכינו שקופיות מיקרוסקופ מצופות ITO באמצעות אוהמטר לזיהוי הצד של הסקופ עם הציפוי המוליך. השתמש בכתב עם קצה יהלום לחרוט ולסימון הצד המצופה ב-ITO של סלייד המיקרוסקופ.
   הערה: יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, משקפי מעבדה, חלוק מעבדה ושרוולי קריוסטט.
2. לבצע קריו-סקסיקט על קריומיקרוטום מחקרי. העבר את רקמות הסקה המוטבעות ב-OCT ממקפיא בטמפרטורה של -80°C לתא הקריומיקרוטום (טמפרטורת תא 30°C, טמפרטורת אובייקט -28°C) על קרח יבש. התקן את דגימות הרקמה להשוואה באמצעות ספקטרומטריית מסה בהדמיה (למשל, בקרה לא נגועה לעומת נגועה ב-C. difficile) על אותו סלייד מיקרוסקופ כדי להבטיח הכנת דגימות זהה של שני סוגי הרקמות ולאפשר השוואות מדויקות של מטבוליטים.
3. בתוך תא הקריומיקרוטום, התקן את הרקמה המוטמעת ב-OCT על צ'אק דגימה באמצעות תמיסת OCT נוספת. לאחר שהפתרון של ה-OCT התקשה, מקבע את הצ'אק לראש הדגימה. התחילו בקריוסקציה בקצב של 10-50 מיקרון כדי להגיע לעומק/מישור הרקמה הרצוי של האיבר.
4. לאחר השגת חתך אופטימלי של הרקמה, יש להתחיל לאסוף חתכים בעובי של 12 מיקרון. מניפולציה עדינה של הפרוסה באמצעות מברשות ציור של אמנים והנח אותה על סלייד מצופה מיקרוסקופ בטפלון.
5. גלגלו את מגלש המיקרוסקופ המצופה ב-ITO מעל קטע הרקמה כדי לאסוף את הרקמה מהמחסנית המצופה בטפלון. הפשר את מקטע הרקמה למחסנית המיקרוסקופ על ידי לחיצה על כף היד לגב המחסנית המצופה ב-ITO. המשיכו להפשיר את המתקן עד שהחלק הרקמתי עובר ממרקם שקוף למרקם אטום/מט.
6. העבר את שקופיות המיקרוסקופ המותקנות על קרח יבש לקופסה יבשה עם חומר ייבוש לאחסון לניתוח באותו יום, או לאחסן בטמפרטורה של -80°C לאחסון ארוך טווח.

3. הכנת רקמות בקרה לא נגועות, לעומת רקמות עכברוש נגועות ב-C. difficile ליישום מטריצה וספקטרומטריית מסה מדימות MALDI

1. בצע יישום מטריצת MALDI (טמפרטורת פיה 30 מעלות צלזיוס, שמונה מעברים, קצב זרימה 0.1 מ"ל לדקה, דפוס CC, זמן ייבוש 0 שניות, 10 psi).
2. ביצוע ספקטרומטריית מסה של MALDI
3. נתח את תמונות היונים ממספר שכפולים ביולוגיים והשווה את התוצאות למשמעות באמצעות השוואות קופסאות עוצמה באמצעות תוכנת SCiLS הסטטיסטית שהוזכרה לעיל.
   הערה: המבחנים וההשוואות הסטטיסטיות המתאימים יהיו תלויים ביישום ויכולים לכלול סגמנטציה מרחבית, מודלים של סיווג וניתוח השוואתי לקביעת תכונות ספקטרליות מובחנות ומתואמות. ניתוחים השוואתיים יכולים לכלול הקצאת ערכי p למאפיינים משמעותיים, יצירת ניתוחי רכיבים עיקריים להשוואות רקמות, והדמיית תרשימי קופסה לזיהוי שונות. כדאי גם להמחיש את הרקמה באמצעות מיקרוסקופיית ברייטפילד של חתך הרקמה שנצבע באמצעות המטוקסילין ואאוזין (H&E) לאחר ספקטרומטריית מסה בהדמיה. זה מאפשר זיהוי ברור של תכונות מורפולוגיות ברקמה וניתן לנתח אותו בהתייעצות עם פתולוג מוסמך.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.2 מיקרום Titan3 מסנני מזרק ניילון	תרמו-סיינטיפיק	42225-NN
מטריצת MALDI 1,5-דיאמינונתלין	סיגמא אולדריץ'	2243-62-1
20 מ"ל Henke Ject luer lock מזרקים	הנקה סאס וולף	4200.000V0
מד ואקום הסעה מסדרת 275i	חברת קורט ג'יי. לסקר	KJL275807LL
ספקטרומטר מסה 7T SolariX FTICR המצויד במערכת לייזר Smartbeam II Nd:YAG MALDI (2 קילוהרץ, 355 ננומטר)	ברוקר דלטוניקס
תמיסת חומצה אצטית, מתאימה ל-HPLC	סיגמא אולדריץ'	64-19-7
אצטוניטריל, מתאים ל-HPLC, דרגת גרדיאנט, ≥99.9%	סיגמא אולדריץ'	75-05-8
תמיסת הידרוקסיד אמוניום, 28% NH3 ב-H2O, ≥99.99% בסיס מתכות זעיר	סיגמא אולדריץ'	1336-21-6
שקיות ביולוגיות אוטוקלביות: 55 גלון	גריינג'ר	45TV10
שקיות הובלת דגימות ביו-מסוכנות (8 על 8 אינץ')	פישר סיינטיפיק	01-800-07
מרק עירוי לב למוח	BD ביוסיינסס	90003-040
C57BL/6 עכברים זכרים	מעבדות ג'קסון
סורק תמונות ומסמכים CanoScan 9000F Mark II	קאנון
מחקר קריומיקרוטום CM 3050S	Leica Biosystems
ארון דסיקטור	סיגמא אולדריץ'	Z268135
כותב קצה יהלום, מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים	פישר סיינטיפיק	50-254-51
כדורי דריריט יבשים	דרירייט	21005
אתנול, הוכחת 200	דיקון לאבס	2701
תוכנת flexImaging	ברוקר דלטוניקס
תוכנת ftmsControl	ברוקר דלטוניקס
מלכודת ואקום מזכוכית	סיגמא אולדריץ'	Z549460
מרסס רובוטי HTX M5 TM	HTX טכנולוגיות
שקופיות מיקרוסקופ מצופות אינדיום טין אוקסיד (ITO)	דלתא טכנולוגיות	CG-81IN-S115
מסנן HEPA בקו למשאבת ואקום	LABCONCO	7386500
מתנול, דרגת HPLC	פישר כימיקל	67-56-1
מתאם שקופית MTP II	ברוקר דלטוניקס	235380
תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)	פישר סיינטיפיק	23-730-571
חוטא וחומר ניקוי Peridox RTU	CONTEC	CR85335
שקופיות מודפסות PTFE (טפלון), מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים	VWR	100488-874
משאבת ואקום סיבובית RV8	אדוארדס	A65401903
להבי מיקרוטום חד-פעמיים Tissue-Tek Accu-edge בעלי פרופיל גבוה	מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים	63068-כ"ס
צינורות ואקום שקופים	קול פאלמר	EW-06414-30
שמן משאבת ואקום אולטרגרייד 19	אדוארדס	H11025011
טרנספורמטור מתח משתנה	Powerstat
מים, מתאימים ל-HPLC	סיגמא אולדריץ'	7732-18-5
בקבוק דוואר רחב הפה	סיגמא אולדריץ'	Z120790