$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הערכת השפעת מעכבי מולקולות קטנות על היווצרות מושבות פליקל וביופילם
- הכינו תמיסה כפולה של מדיום MSgg (מונוסודיום גלוטמט-גליצרול) המגרה ביופילם מוגדר, ללא הסידן כלוריד והקסהידרט כלוריד ברזל(III). לאחר חיטוי המסנן, הוסיפו את כלוריד הסידן. המדיום מוכן לשימוש ישיר, או שניתן לאחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך.
- הכינו את הדילול של 1x MSgg ביום הניסוי.
- מדלל את המדיום של 2x MSgg ל-1x במים מזוקקים סטריליים (פליקלים) או אגר סטרילי בטמפרטורה של 3% חם (80°C) (ביופילמים), והוסף הקסיהידרט כלוריד ברזל (III) לריכוז סופי של 50 מיקרומולר (פליקלים) או 250 מיקרומולר (ביופילמים). הוסף אנטיביוטיקה או מעכבי מולקולות קטנות לריכוז הרצוי וערבב היטב. לדוגמה, כדי לקבל ריכוז סופי של 0.5 מ"מ D-לאוצין ב-30 מ"ל ליצירת פליקלים או ביופילמים, הוסף 196.6 מיקרוליטר של תמיסת D-לאוצין בנפח 76.3 מ"מ (10 מ"ג/מ"ל).
הערה: ההרכב הסופי של 1x MSgg מתוארת בטבלה 1. בהשוואה למתכון המקורי, המדיום הכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל תראונין, וריכוז הברזל לגידול מושבות ביופילם על מדיום MSgg מוצק הוגדל פי 2.5 כדי לייעל את המורפולוגיה של המושבה המקומטת.
- לאחר התגבשות האגר, ייבשו את לוחות ה-MSgg המוצקים בכיסוי ביולוגי למשך 30-45 דקות לפני החיסון.
- כדי לבחור מעכבים ספציפיים שמפריעים למנגנוני היווצרות הפליקולות (איור 1), יש לשלול את הריכוזים המשפיעים על גדילה פלנקטונית וסטטית.
- קביעת גדילה פלנקטונית (עלייה בצפיפות האופטית לאורך זמן בתרבות נוזלית) בעקומת גדילה פשוטה על ידי מדידת צפיפות אופטית של 600 ננומטר בכל שעה עד לשלב הצמיחה הנייח.
- כדי לאשר שהעכירות הנמדדת בתרבות מייצגת ספירות תאים חיים, קבעו את מספר יחידות יצירת המושבה (CFU) של תאים בשלב הגדילה הפלנקטוני מתרבות רעידה במספר נקודות זמן.
- כדי להעריך את השפעת מעכבי מולקולות קטנות על גדילה סטטית של הפליקלות, יש לאסוף תאים בסוף דגירה בת 3 ימים בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס מבאר תרבית תאים עם 24 בארות, מחוסנים באותם תנאים כפי שמתואר בסעיפים 1.7-1.9, וקבעו את ה-CFU. לצורך בקרה זו, השתמשו בזן חסר פליקל שחסר את האופרונים המקודדים את רכיבי המטריצה החוץ-תאית (כלומר, B. subtilis ΔepsH, ΔtasA).
הערה: זן זה מסוגל לגדול בתנאים סטטיים, אך בניגוד לסוג פראי היוצר קליקלים, הוא חסר ביכולת לצוף אל ממשק הנוזל-אוויר, שם הצמיחה מועדפת בשל רמות חמצן מוגברות. לכן, זן חוץ-תאי זה, חסר מטריצה ופליקלות, הוא זן ייחוס מומלץ להערכת גדילה בתנאים סטטיים.
הערה: לדוגמה הספציפית של חומצת האמינו D-לא-קנונית D-לאוצין המתוארת להלן, נשללה השפעה על גדילה פלנקטונית וסטטית בריכוזים שהפריעו להיווצרות הפליקלות. השיטות לקביעת גדילה פלנקטונית וסטטית מתוארות בפירוט.
- להוציא את B. subtilis ממלאי של -80°C (תרבית LB של 109 תאים/מ"ל מוקפאים ב-20% גליצרול) כדי לבודד מושבות בודדות על פלטת אגר LB-1.5% עם קצה סטרילי או מקל אפליקטור.
- גדל בלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
- שלב קריטי: לעיכוב פליקלים חזק על ידי חומצות האמינו הלא-קנוניות כמו D-לוצין, יש לגדל מושבה אחת שנקטפה מצלחת אגר LB-1.5% בציר LB בנפח 3 מ"ל בטמפרטורה של 37°C למשך 4 שעות בתנור ניעור (מהירות רעידה 200 סל"ד). החלף את מרק ה-LB במדיום MSgg שמעורר ביופילם לפני ההזרקה על ידי צנטריפוגה של תרבית התחלה של 1.5 מ"ל למשך 4 דקות ב-6,000 x גרם, הסרת הסופרנטנט בזהירות, והחזרת הגלגל ב-1.5 מ"ל MSgg. שאר התרבות אפשר להידחה. חשוב: כדי להבטיח את עמידות המערכת, צפיפות האופט ב-600 ננומטר (OD600) של תרבית ההתחלה השטופה צריכה להיות בין 0.6 ל-1.
- במהלך גדילת תרבית ההתחלה, יש להכין צלחת רב-צלחות של תרבית תאים בת 12 בארות המכילה 3 מ"ל מדיום MSgg ללא או עם טווח ריכוז של מעכב המולקולה הקטנה (למשל, 0.3, 0.5, 1 מ"מ D-לאוצין). כדי לשלול השפעות קצה, פזר את מיקום הריכוזים השונים על פני הצלחת הרב-צלחתית. חלופה נוספת היא להשתמש בצלחות רב-צלחות עם תרבית תאים עם 24 בארות המכילות 1.5 מ"ל מדיום MSgg.
- החסנו את הבארות של צלחת רב-צלחות תרבית תאים בת 12 בארות ב-3 מיקרולטר של תרבית ההתחלה השטופה (דילול של 1:1,000).
הערה: ניתן להשתמש ביחס דילול נמוך יותר, כלומר 1:500. דבר זה מקצר את זמן ההתפתחות של הפליקלים. - גדלו את הפליקלים בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס בתנאים סטטיים למשך שלושה ימים. אין להזיז את הפליקלות בזמן זה, שכן זה עלול להשפיע על המורפולוגיה הסופית של פני השטח.
- צלם תמונות עם משקפת וחשיפה הומוגנית של ברק. חלופה נוספת היא לצלם את הפליקלים עם מצלמה ברזולוציה גבוהה. כדי למנוע ארטיפקטים הנגרמים מזוויות אור וצללים לא אחידים, צלם תמונות מלמעלה כשהמצלמה מחוברת על חצובה והשתמש במקור אור רך וגדול בזווית של 45° משני הצדדים.
הערה: שיטה חלופית לחקר רב-תאי של B. subtilis היא בדיקת מושבת הביופילם על מדיום מוצק שמעורר ביופילם MSgg. בדומה לפליקלים, בדיקה זו מאפשרת חקר תהליכים מרחביים-זמניים. לאחר שנקבע טווח הפעילות של מעכבי מולקולות קטנות, ניתן לחקור את השפעתם על יצירת מושבות ביופילם. - כדי לגדל מושבות ביופילם, יש לאתר באופן סימטרי 1.5 מיקרוליטר מהפרה-רבטורל הלא שטוף (שלב 1.7) על צלחת האגר המיובשת MSgg 1.5% בעזרת תבנית — 4 טיפות לכל צלחת פטרי בקוטר 8.5 ס"מ. תן לטיפות להיספג לפלטה לפני שאתה מזיז אותן.
הערה: התבנית מסייעת לקבל התפלגות שווה של מושבות הביופילם באזור שבו גדלים התאים. להכנת התבנית, צייר את שטח הצמיחה הכולל בקנה מידה מקורי, חלק אותו למגזרים שווים וסימן את המרכז. עבור צלחת פטרי עגולה בקוטר 8.5 ס"מ, זה מקצה 14ס"מ רבע למושבה ביופילם אחת. - דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. במהלך תקופה זו, מושבות ביופילם מתפתחות ויוצרות מבנה תלת-ממדי ומקומט.
- צלם תמונות כמו בשלב 1.11.
טבלה 1. החיבור הסופי של MSgg 1x שימש במחקר זה.
| 1.925 מ"מ | אסלגן פוספט מונובסיסי |
| 3.075 מ"מ | פוספט אשלגן די-בסיסי |
| 100 מ"מ | חומצה פרופנסולפונית 3-(N-מורפולינו), pH 7.1 |
| 2 מילימטר | מגנזיום כלוריד הקסיהידרט |
| 700 מיקרומטר | סידן כלוריד חסר מים |
| 50 מיקרומוםאמפר | הקסיהידרט כלוריד ברזל(III) |
| 125 מיקרומוםb |
| 1 מיקרומטר | כלוריד אבץ חסר מים |
| 2 מיקרומטר | תיאמין הידרוכלוריד |
| 50 מיקרוגרם/מ"ל | טריפטופן |
| 50 מיקרוגרם/מ"ל | פנילאלנין |
| 50 מיקרוגרם/מ"ל | תראונין |
| 0.5% (v/v) | גליצרול חסר מים |
| 0.5% (עם הצבע) | חומצה L-גלוטמית מונוסודיום מלח הידראט |
| Aלבדיקת פליקל; Bלבדיקת ביופילם |
