בדיקת עמידות לאתנול להערכת שלמות מטריצת הביופילם

תקציר

מקור: בוכר, ט. ואחרים. שיטות לחקר ביופילמים של B. subtilis כמודל לאפיון מעכבי ביופילם של מולקולות קטנות. J. Vis. Exp. (2016).

הסרטון הזה מדגים כיצד שלמות מטריצת הביופילם משפיעה על עמידות חיידקים לאתנול על ידי השוואת יחידות יוצרות מושבות בביופילמים לא מטופלים ומופרעים על ידי מעכבים. הפחתת CFU בדגימות שטופלו במעכבים מראה כי מטריצת החוץ-תאית חיונית להגנה על תאים מוטמעים בביופילם מפני לחץ אנטימיקרוביאלי.

פרוטוקול

1. מבחן עמידות לאתנול

1. גדלו ביופילמים ואחרי 68 שעות של גדילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, חתכו את מושבות הביופילם לשני חלקים שווים בעזרת להב גילוח והתבנית.
2. הרימו בזהירות כל חצי ממושבת הביופילם מלוח האגר בעזרת מרית קטנה והעבירו אותה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המכיל 500 מיקרוליטר של מלח מפוזר פוספט (PBS). אם צריך, גרדו את התאים שנותרו מהפלטה והעבירו גם הם לצינור המיקרוצנטריפוגה.
   הערה: החצי השני של מושבת הביופילם מטופל באופן שונה, בהתאם לשאלה האם זו מערכת הביקורת או לבדיקת העמידות לסוכני עיקור.
3. לבקרה, דגרו את החצי השני של מושבת הביופילם ב-500 מיקרוליטר PBS. כדי להעריך עמידות לסוכני עיקור, העבר את החצי השני של מושבת הביופילם לאתנול 500 מיקרוליטר 50% (v/v).
   הערה: ניתן להשתמש בסוכני עיקור חלופיים כמו נתרן היפוכלוריט. לכל חומרי החיקור המשמשים יש לקבוע את הריכוז הפעיל וזמן הדגירה בניסוי ראשוני.
4. דגרו את מושבות הביופילם במשך 10 דקות על שולחן בטמפרטורת החדר.
5. צנטריפוגות את מושבות הביופילם למשך 5 דקות בעוצמה של 18,000 x גרם והסר בזהירות את הסופרנטנט עם פיפטה. הוסף 300 מיקרול של PBS.
6. סוניקציה קלה של התאים (משרעת 10%, פולס 5 שניות) עם המיקרו-קצה של סוניקטור.
   הערה: אנרגיית הסוניקציה חייבת להיות מספקת להפרדת אגרגטים ביופילמים. עם זאת, סוניקציה חזקה מדי עלולה לפגוע בתאים. ודאו מראש במיקרוסקופיה אור שאנרגיית הסוניקציה שבה משתמשים אינה מפרקת את התאים ושכל האגרגטים מומסים.
7. הוסף 700 מיקרול PBS לנפח הסופי של 1 מ"ל. בצע דילול סדרתי (עד ^10-7) ב-PBS ופזר 100 מיקרוליטר של 3 דילול על פלטת אגר LB-1.5% באמצעות חרוזי זכוכית סטריליים.
   הערה: יש לקבוע את הדילול האופטימלי לציפוי בניסוי ראשוני, שכן זה תלוי בכמות התאים במושבת הביופלם המעניינת ובשיעור ההישרדות של התאים בתגובה לסוכן הסטריליזציה.
8. דגרו את הלוחות במהלך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, ספרו את ה-CFU וקבעו CFU/ml. מה-CFU/ml הסופי של כל מושבת חצי ביופילם, חשב את אחוז הניצולים.
   הערה: כאשר מבוצעים ומנותחים כפי שמתואר, שני חצאי מושבת הביופילם הביקורת והחצי הלא מטופל לעומת החלק המטופל באתנול של מושבת הביופילם הלא מטופלת אמורים להניב הבדלים מתחת ל-10% בספירת התאים הקיימאים, ולאמת את הסימטריה או העמידות של המושבה, בהתאמה. לחלופין, ניתן לייצג את התוצאות ב-CFU כולל. ספירת התאים של המושבה הביקורתית והביופילם הלא מטופלת צריכה להישאר באותו סדר גודל. לעומת זאת, מספר התאים של החצי המטופל באתנול של מושבת ביופילם קטנה מטופלת במולקולות צפוי לרדת לפחות בשני סדרי גודל כדי לטעון לרגישות מוגברת לסוכן הסטריליזציה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בורק לוריה, לנוקס	דיפקו	240230
בקטו אגר	דיפקו	214010
אסלגן פוספט מונובסיסי	סיגמא, 136.09 גרם למול	P0662-500G
פוספט אשלגן די-בסיסי	פישר סיינטיפיק, 174.18 גרם למול	BP363-1
חומצה פרופנסולונית 3-(N-מורפולינו)	פישר סיינטיפיק, 209.27 גרם למול	BP308-500
מגנזיום כלוריד הקסיהידרט	מרק, 203.30 גרם למול	1.05833.0250
סידן כלוריד חסר מים	ג'יי.טי. בייקר, 110.98 גרם למוליל	1311-01
טטרהידרט כלוריד מנגן(II)	סיגמא, 197.91 גרם למול	31422-250G-R
הקסיהידרט כלוריד ברזל(III)	סיגמא, 270.30 גרם לחודש)	F2877-500G
כלוריד אבץ חסר מים	אקרוס אורגניקס, 136.29 גרם למול	424592500
תיאמין הידרוכלוריד	סיגמא, 337.27 גרם למול	T1270-100G
L-טריפטופן	פישר סיינטיפיק, 204.1 גרם למוליל	BP395-100
L-פנילאלנין	סיגמא, 165.19 גרם למול	P5482-100G
L-תראונין	סיגמא, 119.12 גרם למול	T8625-100G
גליצרול חסר מים	Bio-Lab Itd	712022300
מלחים מונוסודיום של חומצה L-גלוטמית ממים הידרציה	סיגמא, 169.11 גרם למול	G1626-1KG
ד-לוצין	סיגמא, 169.11 גרם למול	855448-10G
אתנול חסר מים	גדות	830000054
להב סכין גילוח	אדיסון	NA
ניירות פילטר תאית עגולים	ווטמן, 90 מ"מ	1001-090
גלוטראלדהיד	EMS (מדע מיקרוסקופיה אלקטרונית), 25% במים	16220
פאראפורמלדהיד	EMS, 16% במים	15710
נתרן קקודילאט	מרק, 214.05 גרם למול	8.2067
כלוריד סידן 2-הידראט	מרק, 147.02 גרם למול	1172113
שייקר 37 מעלות צלזיוס	ניו ברונסוויק סיינטיפיק אינוו42	NA
צנטריפוגה	צנטריפוגה שולחנית אפנדורף 5424	NA
סונייפר דיגיטלי, דגם 250, בשימוש עם מיקרוטיפ דאבל סטפ	ברנסון	NA
חממה 30 מעלות צלזיוס	קלסר	NA
חממה 23 מעלות צלזיוס	קלסר	NA
מערכת סינון, 500 מ"ל, פוליסטירן	קורניג אינקורפורייטד	NA
שייקר סיבובי - סיבובי אורביטרון II	בוקל	NA