הכנת מושבות ביופילם חיידקיות לניתוח מורפולוגי

תקציר

מקור: Bucher, T., ואחרים, מתודולוגיות לחקר Biofilms של B. subtilis כמודל לאפיון מעכבי ביופילם של מולקולות קטנות. J. Vis. Exp.(2016)

הסרטון הזה מדגים את הכנת מושבות ביופילם חיידקיות בוגרות להדמיה ברזולוציה גבוהה. הוא עוסק בשלבי קיבוע, ייבוש, התקנה וציפוי מתכת לשימור והדגשת מורפולוגיית ביופילם.

פרוטוקול

הכנת דגימת מושבת ביופילם למיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת

1. לגדל מושבות ביופילם חיידקיות.
2. הכינו מנה טרייה של גלוטראלדהיד 2% (v/v), 3% (v/v) תמיסת פרפורמלדהיד ב-100 מ"מ מול סודיום קקודילאט, בופר סידן כלוריד 5 מ"מ, pH 7.3. הכינו 5 מ"ל קיבע לכל צלחת פטרי בקוטר 8.5 ס"מ.
   אזהרה: גלוטראלדהיד ופארפורמלדהיד מסוכנים. טפל בהם עם ציוד בטיחות בתוך מכסה מנוע כימי. להשליך את התמיסות והחומרים המזוהמים בפסולת המסוכנת.
3. הוסיפו בזהירות את הקיבוע למושבות הביופילם, מבלי לזרוק ישירות מעל הביופילמים.
   הערה: עקב האופי ההידרופובי של מושבת הביופילם, המושבות מתנתקות לאט מהאגר ומתחילות לצוף.
4. אטום בזהירות את הלוחות עם רצועת פרפילם. דגרו על שייקר סיבובי במשך שעתיים בטמפרטורת החדר והעבירו את הלוחות לטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
5. למחרת, הסר בזהירות את הנוזל באמצעות פיפטת פסטר המחוברת למשאבת ואקום.
6. הוסיפו בזהירות 10 מ"ל 100 מ״מ סודיום קקודילאט, 5 מ״מ בופר סידן כלורי כדי לשטוף את הביופילם ולדגור במשך 5 דקות. הסר בעדינות את הנוזל עם פיפטת זכוכית פסטר מפינת הצלחת כדי למנוע נזק לביופילם, והוסף תמיסת שטיפה טרייה באמצעות פיפטה עדינה. חזור על השלב הזה פעם אחת.
7. להתייבשות מושבות הביופילם, יש לבצע את השלבים הבאים: 2x 5 דקות ב-DDH₂O; 2x 20 דקות באתנול 30%; 2x 20 דקות באתנול 50%; 2 פעמים 20 דקות באתנול 70; 2x 20 דקות באתנול 96%; 2 פעמים 30 דקות באתנול 100%.
   1. הוסיפו 15 מ"ל נוזל לכל צלחת פטרי בקוטר 8.5 ס"מ בכל שלב והסירו את הנוזל בזהירות לאחר כל דגירה.
8. השתמש באחת משתי שיטות שונות לייבוש הדגימות מאתנול.
   1. לייבוש באוויר מאתנול:
      1. חתוך נייר סינון תאית (קוטר 9 ס"מ) לרבעים. טבלו לזמן קצר רבע אחד באתנול של 100%, ואז העבירו בזהירות מושבת ביופילם צפה אליהם. שים את נייר הסינון הרטוב בצלחת פטרי מרופדת בנייר פילטר. כסו את צלחת הפטרי ותנו למושבות הביופילם להתייבש בלילה בתוך מכסה כימיקלים.
9. ציפוי גזע מיקרוסקופ אלקטרוני בסרט פחמן. בעזרת פינצטה, העבירו בזהירות את מושבות הביופילם אל הגזע. חבר כל מושבה לקצה על ידי הוספת גשר דק מסרט פחמן, שהוא חיוני להסרת מטען תחת קרן האלקטרונים. בשלב זה, יש לטפל במושבות הביופילם בזהירות שכן הן מאוד שבירות. אחסן את הדגימות במייבש לפחות 24 שעות או עד לבדיקה.
10. ביום הבדיקה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), ציפוי את מושבות הביופילם במשך 2 דקות בזווית של 60° במכה מזהב-פלאדיום. חזור על שלב זה פעמיים וסובב את הדגימות ב-120° ביניהם. בסוף, משפשפים את הדגימות פעם אחת למשך 3 דקות מהחלק העליון. השכבה הדקה של 20 ננומטר של זהב-פלאדיום משפרת את המוליכות ומגבירה את הניגודיות של הדגימה להדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
11. אחסן את הדגימות במייבש כדי למנוע הידרציה מחדש של הדגימה עד להדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
גליצרול חסר מים	Bio-Lab Itd	712022300
אתנול חסר מים	גדות	830000054
להב סכין גילוח	אדיסון	NA
ניירות פילטר תאית עגולים	ווטמן, 90 מ"מ	1001-090
גלוטראלדהיד	EMS (מדע מיקרוסקופיה אלקטרונית), 25% במים	16220
פאראפורמלדהיד	EMS, 16% במים	15710
נתרן קקודילאט	מרק, 214.05 גרם למול	8.2067
כלוריד סידן 2-הידראט	מרק, 147.02 גרם למול	1172113
מתקן אלומיניום קצר	חוב"ל, ראש משובץ	75230
סרט דבק פחמן	EMS	77825-12
שייקר 37 מעלות צלזיוס	ניו ברונסוויק סיינטיפיק אינוו42	NA
חממה 30 מעלות צלזיוס	קלסר	NA
חממה 23 מעלות צלזיוס	קלסר	NA
שייקר סיבובי - סיבובי אורביטרון II	בוקל	NA
מצפה S150 Sputter	אדוארדס	NA
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק סביבתי	XL30 ESEM FEG פיליפס (FEI)	NA