מידול זיהום במעי בזחלי דגי זברה באמצעות חיידקים המועברים במזון

תקציר

מקור: פלורס, א. ואחרים. שימוש בפרוטוזואן Paramecium caudatum ככלי לזיהומים המועברים במזון בזחלי דגי זברה. J. Vis. Exp. (2019).

הסרטון הזה מדגים את השיטה לקביעת מודל זיהום חיידקי במעי המועבר במזון לזחלי דגי זברה על ידי האכלה בפרמסיה הנגועה ב-E. coli פלואורסצנטי.

פרוטוקול

1. זיהום במזון של דגי זברה
   1. דגרו חיידקים עם Paramecia.
      1. הכינו קו-קולטורה של Paramecium caudatum ו-Escherichia coli MG1655 בלילה שלפני ההדבקה. שלבו 8 מ"ל מדיום E3, 1 מ"ל של תרבית פרמציה מתמשכת, ו-1 מ"ל של תרבית E. coli MG1655 (OD₆₀₀ = 1.0) שהוחזרו לבקבוק 1x E3 בבקבוק תרבית רקמה T25. דגרו את הבקבוקים בטמפרטורת החדר (RT) במהלך הלילה. לכל מצב טיפול, הכן שני בקבוקי פרמסיה.
      2. חיסון מדיום גידול חיידקים (LB (ציר ליזוגני): 1 גרם לליטר טריפטון, 0.5 גרם לליטר תמצית שמרים, 1 גרם לליטר NaCl) בזן החיידק המדבק על ידי איסוף מושבה חיידקית בודדת מצלחת באמצעות לולאת חיסון סטרילית. דגרו את התרבית הנוזלית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והשאירו רועדת בקצב של 110 סיבובים לדקה (סל"ד) במהלך הלילה.
         הערה: יש ללבוש ציוד מגן אישי (מעיל מעבדה וכפפות), ויש להשתמש במתקני בטיחות ביולוגית ברמה 2 בעת טיפול בחומרים זיהומיים.
      3. ביום הבא, מדד את מנת האורגז₆₀₀ של תרבית הלילה. חשב את נפח התרבית הנדרש להשגת OD600 של 1 כאשר הוא תלוי מחדש ב-11 מ"ל של מדיה.
      4. קצור את נפח החיידקים באמצעות צנטריפוגציה ב-6,000 x גרם למשך 5 דקות, נפח אחד לכל בקבוק פרמסיה. להשליך את הסופרנטנט ולהחזיר את הכדור החיידקי ל-1 מ"ל מדיום E3.
      5. באופן אופציונלי, לצבוע את החיידקים בצבע פלואורסצנטי.
         1. הוסף 1 מיקרוליטר של צביעת חיידקים FM 4-64FX (תמיסת מקורית של 5 מ"ג/מ"ל). כסות את הצינור בנייר כסף כדי להגן מפני הלבנת פוטו, ודוגר את הצינור המסתובב בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
         2. הסר צבע עודף על ידי שטיפה עם 1x E3: חיידקי פלט בצנטריפוגה ב-6,000 x גרם למשך 1.5 דקות, ואז החזירו את הכדור ל-1 מ"ל מדיום E3. חזור על שלב הכביסה פעמיים.
         3. קצור חיידקים מוכתמים באמצעות CNTRIFUGATION בעוצמה של 6,000 x גרם למשך 5 דקות. להשליך את הסופרנטנט ולהחזיר את הכדור החיידקי ל-1 מ"ל מדיום E3.
      6. הוסיפו 1 מ״ל מהמתנס החיידקי לכל אחד משני הבקבוקים של פרמסיה טרייה. תדגר ב-RT לשעתיים.
         הערה: אם עובדים עם חיידקים מוכתמים, דגרו בחושך ב-RT למשך שעתיים
2. קו-קולטורה של חיידקי שטיפה/פרמסיה
   1. משלבים את תכולת שני הבקבוקים של קו-קולטורה של פרמסיה/חיידקים לצינור קונוסי של 50 מ"ל. דגימות צנטריפוגה בעוצמה של 300 x g בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ודאו שהצנטריפוגה מקוררת מראש לפני שלב זה.
   2. הסר כ-10 מ"ל של סופרנטנט E3 באמצעות פיפטה סרולוגית והוסף כ-10 מ"ל של 1x E3 טרי לצינור הקוני.
      הערה: במהלך כל שלבי הכביסה, חשוב להיות מהירים מאוד בהסרת הסופרנטנט, שכן הפרמציה תתחיל לשחות החוצה מהכדור. סובבו והוציא סופרנטנט מצינור אחד בכל פעם כדי להבטיח טיפול מהיר מספיק בשלב זה, ולמנוע אובדן פרמסיה בסופרנטנט.
   3. סובבו דגימות באמצעות צנטריפוגציה ב-300 x גרם בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הסר כ-10 מ"ל של סופרנטנט E3 באמצעות פיפטה סרולוגית, והוסף כ-10 מ"ל של 1x E3 טרי לצינור הקוני. חזור על השלב פעמיים.
   4. דגימות צנטריפוגה ב-300 x גרם בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הסר כ-10 מ"ל מהסופרנטנט E3, תוך זהירות שלא להפריע לכדור.
   5. החזירו את הכדור ל-10 מ"ל הנותרים של מדיום E3 והעבירו 500 מיקרוליטר מהמתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל. הגריל את 500 מיקרולטר הפרמציה על ידי צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות כדי לספור את מספר הפרמציות.
   6. הסר 400 מיקרוליטר מסופרנטנט E3 מהדגימה של 500 מיקרוליטר. הוסיפו 20 מיקרוליטר של 36.5% תמיסת פורמלדהיד ל-100 מיקרו-ליטר הנותרים של פרמציה והשלים בעדינות מחדש, ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס.
      הערה: שלב זה הורג את הפרמציה כדי לאפשר ספירה.
   7. מדד את הנפח הכולל בפועל באמצעות הפיפטה והקלט. מדלל את תליית הפרמסיה ביחס 1:1 v/v עם תמיסה כחולה של 0.4%.
   8. השתמש במונה תאים או המוסיטומומטר כדי לספור את מספר הפרמציה המתה למ"ל.
      הערה: בגלל שלב הקיבוע הקודם, רוב הפרמציות יהיו מתות בשלב זה, אך מספר זה משקף את מספר הפרמציות החיות בניסוי הקו-אינקובציה. המחברים לא מצאו מוות משמעותי מפרמסיה כתוצאה משילוב של דגירה חיידקית, ולכן ניתן להתעלם מזה כגורם כאן.
3. דגירה משותפת של זחלי פרמסיה ודגי זברה
   1. חשב את ריכוז הפרמציה בצינור הקוני של 50 מ"ל
   2. חשב את נפח הפרמציה השטופה הנדרש לריכוז של 2 x 10⁵ פרמציה למ"ל בנפח סופי של 3 מ"ל E3.
      הערה: ריכוז הפרמציה ניתן להתאמה בהתאם למינון החיידקים הרצוי, הנתון לאופטימיזציה.
   3. הרדמו דגי זברה על ידי הוספת טריקאין ב-100 מ"מ טריס pH 8.0 לריכוז סופי של 100 מ"ג/ליטר. העבר 10 דגי זברה לכל באר של לוח בן 6 בארות לנפח כולל של 3 מ"ל E3 טרי המכיל את הריכוז המתאים של פרמסיה. ודאו שהזחלים מועברים בכמות מינימלית של נוזל כדי להבטיח שהם יתאוששו מההרדמה בבאר המקבל.
   4. דגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס במשך שעתיים בדגירה יומית באור יום, כדי להבטיח תנאי תאורה מיטביים לטרף.
   5. שטפו דג זברה לפחות 5 פעמים על ידי העברת דגים לבאר חדשה המכילה 3 מ"ל E3 טרי המכיל 100 מ"ג לליטר טריקאין בכל פעם.
      הערה: אל תנסה להשמיט את הטריקאין בשלב הכביסה. העברת זחלים ניידים ללא הרדמה מעלה את הסיכון לנזק ולמצוקה לבעל החיים.
   6. באופן אופציונלי, להכין דגי זברה להדמיה על ידי הטמעת דג זברה ב-3 מ"ל של אגרוז 1% נמס נמוך בלוח שחור עם 6 בארות: אגרוז נמס נמוך מורכב מ-1xE3 ומחומם במיקרוגל. לאחר המותך, הוסף טריקאין לריכוז סופי של 160 מ"ג/מ"ל. מקמו את הדגים תחת מיקרוסקופ סטריאו, באמצעות קצה ג'ל קצוץ, ודאו שהראש משמאל והזנב מימין (איור 1). המתינו 5 דקות עד שהאגרוז יתייצב, ואז שימו על הדג המוטמעת 1x E3 המכיל 160 מ"ג/מ"ל טריקאין להדמיה.

תוצאות

איור 1: התיישבות דגי זברה עם חיידקים. דגי זברה ב-5 dpf נותרו לא נגועים (A) או יושבו ב-mCherry המבטא (B) E. coli או (C) סלמונלה אנטריקה . ניסויים בזיהום עשויים להתבצע בדגים מס...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Paramecium caudatum, חי	קרוליינה	131554	לא, לא לאחסן תרביות גידול מתחת לטמפרטורת החדר
0.4% תמיסת טרייפן בלו	סיגמא	T8154-20ML	נוזלי, מסונן סטרילי, מתאים לתרבות תאים; מוכן ב-0.81% נתרן כלוריד ו-0.06% אשלגן פוספט, די-בסיסי
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	סיגמא	276855-100ML	אחסון בארון בטיחות מממס
אשריכיה קולי, MG1655	ATCC	ATCC 700926	ניתן להחליפו בכל זן אחר של E. coli שאינו פתוגני
כתם FM 4-64FX	תרמו פישר	F34653	אליקווט והחנות מוקפאת
פורמלדהיד	סיגמא	F8775-4X25ML
LB Broth	סיגמא	L3397-1KG
טבליות מלח עם בופר זרחן	תרמו פישר	18912014
טטרציקלין	סיגמא	87128-25G	רעיל, מגרה
טריקאין (אתיל 3-אמינובנזואט מתאנסולפונט)	סיגמא	E10521-10G
טריטון X-100	סיגמא	X100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4%	סיגמא	93595-50ML
UltraPure Low Meting Point Agarose	תרמו פישר	16520050
המוציטומטר או מונה תאים	כל
סטריאומיקרוסקופ	כל
צנטריפוגה שולחנית
מיקרוגל
גלגל סיבוב
חמם ניעור מחומם
מתקני שחייה
אקווריומי רבייה