פיתוח ביופילם מונולייר חיידקי באמצעות כור אלקטרוכימי

תקציר

מקור: Tokunou, Y. ואחרים, זיהוי אלקטרוכימי של השפעת איזוטופ קינטי של דויטריום על הובלת אלקטרונים חוץ-תאית ב-Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את ההרכבה וההפעלה של מודל כור אלקטרוכימי שנועד לדמות יצירת ביופילם על פני אלקטרודות. גירוי אלקטרוכימי מבוקר מקדם הידבקות מיקרואורגנית, מה שמוביל להתפתחות הדרגתית של ביופילם מונו-שכבה חיידקית.

פרוטוקול

1. בניית כור אלקטרוכימי בעל שלוש אלקטרודות (איור 1)
   1. שים תת-תחמוצת מדומה בדיל (ITO) כאלקטרודה הפועלת בתחתית הכור.
   2. לאחר מכן, יש להכניס גליל זכוכית (קוטר 2 ס"מ) וכיסוי פוליטטראפלואוראתילן (PTFE). לאחר מכן מכניסים כלוריד כסף/כסף (Ag/AgCl) (כלוריד אשלגן, KCl רווי) וחוט פלטינה לכור כאלקטרודות ייחוס ונגד, בהתאמה.
      הערה: כדי למנוע דליפת אוויר ותמיסה, הכנס יריעת גומי בוטיל בין כל רכיב.
   3. הוסף 4.0 מ"ל מדיום מוגדר (DM) בתוספת 10 מ"מ לקטט ותמצית שמרים של 0.5 גרם ל-L אל הכור האלקטרוכימי.
   4. לאחר אישור שאין דליפה מהכור האלקטרוכימי, הזרימו את גז החנקן אל הכור האלקטרוכימי במשך 20 דקות כדי לשמור על תנאים אנאירוביים בתוך הכור האלקטרוכימי.
      הערה: כדי למנוע זיהום עם מיקרובים אחרים, יש לסנן את הגז לפני שהוא זורמת אל הכור האלקטרוכימי.
   5. חבר את הכור האלקטרוכימי לפוטנציוסטט והפעיל +0.4 וולט (לעומת אלקטרודת מימן סטנדרטית, SHE) על אלקטרודת ITO, תוך שמירה על טמפרטורת הכור האלקטרוכימי ב-30°C באמצעות מערכת מחזור מים חיצונית.
      הערה: כדי למנוע השפעת שדה חשמלי חיצוני, יש להכניס את הכור האלקטרוכימי לכלוב פאראדיי.
2. גידול אלקטרוכימי של תאי S. oneidensis MR-1 (איור 1 ואיור 2)
   1. כוונן את צפיפות התאים של ההשעיה שהתקבלה בשלב 1.1 לצפיפות אופטית של 1.43 ב-600 ננומטר (OD₆₀₀) עם DM בתוספת 10 מ"מ לקטט ותמצית שמרים של 0.5 גרם לליטרים.
      הערה: כדי לקבל את ה-OD₆₀₀ הנכון, יש להחיל את תליית התא של OD₆₀₀ ≤ 0.8 על ספקטרומטר UV-vis לפני כיוון ה-OD₆₀₀ ל-1.43.
   2. מוסיפים 0.3 מ"ל מהמתלה של התא אל הכור האלקטרוכימי דרך פתח ההזרקה באמצעות מזרק: ה-OD₆₀₀ בכור משתנה ל-0.1.
      הערה: הוספת תליית תא של 0.3 מ"ל עם OD₆₀₀ = 1.43 לתוך כור אלקטרוכימי המכיל מדיום של 4.0 מ"ל מביאה ל-4.3 מ"ל תמיסה עם OD₆₀₀ = 0.1. כאשר משתמשים בכורים אחרים עם נפחים שונים, נדרש חישוב צפיפות התא.
   3. המשך את היישום הפוטנציאלי ב-+0.4 וולט (לעומת SHE) לאלקטרודת ITO למשך 25 שעות.
      הערה: לצורך יצירת ביופילם מונולייר על אלקטרודת ITO, יש לוודא שהזרם המיוצר מציג סטייה של פחות מ-50% מאיור 2.

תוצאות

איור 1: כור אלקטרוכימי ששימש במחקר זה. צילום של התא האלקטרוכימי לפני הבנייה (א) ואחרי הבנייה (ב). (ג) איור סכמטי של הכור האלקטרוכימי לאחר 25 שעות של חיסון אלקטרוכימי ב-+0.4 וולט לעומת SHE.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
גליל זכוכית	לא זמין	לא זמין	מיוצר בהתאמה אישית, משמש ככור אלקטרוכימי
כיסוי ובסיס PTFE	לא זמין	לא זמין	מיוצר בהתאמה אישית, משמש ככיסוי וכבסיס לכור האלקטרוכימי
גומי בוטיל	לא זמין	לא זמין	מותאם אישית, מוכנס בין כל רכיב של הכור האלקטרוכימי
ספטה	מדעי GL	3007-16101	משמש כנמל הזרקה לכור אלקטרוכימי
אלקטרודת תחמוצת בדיל (ITO) עם אינדיום	GEOMATEC	מס' 0001	משמש כאלקטרודה עובדת, 5Ω/sq
אלקטרודה רוויה של Ak/AgCl KCl	הוקוטו דנקו	HX-R5	משמש כאלקטרודה ייחוס, Φ0.30 מ"מ
חוט פלטינה	שיתוף הפעולה של נילאקו	PT-351325	משמש כאלקטרודה נגדית
לוריה-ברטאני (LB) ברוט, מילר	בקטון, דיצ'קינסון ושות'	244620	מדיום לקדם-גידול של S. oneidensis MR-1
בקטו אגר	בקטון, דיצ'קינסון ושות'	214010
NaHCO₃	וואקו	191-01305	משמש למדיום מוגדר (DM)
CaCl₂·2H₂O	וואקו	031-00435	משמש ל-DM
NH₄Cl	וואקו	011-03015	משמש ל-DM
MgCl₷6H₂O	וואקו	135-00165	משמש ל-DM
NaCl	וואקו	191-01665	משמש ל-DM
2-[4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיניל] חומצה אתאנסולפונית (HEPES)	דוג'ינדו	346-08235	משמש ל-DM
תמיסת נתרן לקטט	וואקו	195-02305
תמצית שמרי בקטו	בקטון, דיצ'קינסון ושות'	212750
תחמוצת דויטריום (D, 99.9%)	מעבדות איזוטופ קיימברידג' בע"מ.	DLM-4-PK	אדיטיבציה לניסויי אפקט איזוטופים קינטיים
חממה	טוקיו ריקאקיקאי בע"מ.	LTI-601SD	משמש לגידול טרום-גידולי
שייקר	TAITEC	NR-3	משמש לגידול טרום-גידולי
מכונת אוטוקלאב	טומי סייקו בע"מ.	LSX-500	משמש לעיקור הכור האלקטרוכימי והמדיום
ספסל נקי	סניו	MCV-91BNF	משמש למניעת זיהום של הכור האלקטרוכימי והתווך במיקרואורגניזמים אחרים
מפריד צנטריפוגה	אפנדורף	5430R	נדרשת מהירות סיבוב של עד 6000×g
גנרטור גז חנקן	פואקו בע"מ	PNTN-2	ניתן גם להשתמש בצילינדר גז חנקן במקום גנרטור גז
ספקטרומטר UV-vis	שימדזו	UV-1800	משמש לאופטימיזציה של צפיפות תאים
פוטנציוסטט	ביולוגיקה	VMP3	משמש ליצירת ביופילם וניסויים באפקט איזוטופים קינטיים
סירקולטור מים תרמיים	כאחד	TR-1A	משמש לתחזוקת טמפרטורת הכור האלקטרוכימי
כלוב פאראדיי	הוקוטו דנקו	HS-201S	משמש לניסויים אלקטרוכימיים