המחשת לחץ חמצוני שנגרם על ידי פתוגן ב-C. elegans באמצעות SKN-1 מתויג GFP

תקציר

מקור: נג'י, א. ואחרים. חקר לחץ חמצוני הנגרם על ידי קבוצת המיטיס סטרפטוקוקי ב-Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את השימוש בחלבון ירוק פלואורסצנטי מתויג SKN-1 ב-C. elegans לניטור לחץ חמצוני על ידי מעקב אחר פלואורסצנציה ירוקה. תולעים שנחשפו ל-S. gordonii מראות פלואורסצנציה גרעינית חזקה, המאשרת לחץ שנגרם על ידי פתוגנים, בעוד שתולעים שניזונו ב-E. coli מציגות פלואורסצנציה ירוקה מפוזרת בציטופלזמה, מה שמעיד על הפעלה מינימלית של SKN-1.

פרוטוקול

1. תצפית על מיקום SKN-1 בתגובה לזיהום ב-Streptococcus gordonii

1. הוסיפו ~100 זחלים L4 לכל תמצית שמרים של טוד–היואיט (THY) שזרעו בסטרפטוקוקוס ולכל פלטת אגר של תווך גדילה נמטודה (NGM) עם זריעה של E. coli. השתמש בשלוש צלחות לכל זן חיידק. דגרו את הצלחות למשך 2 עד 3 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
2. לאחר מכן, מוציאים את הלוחות מהאינקובטור, שוטפים אותן עם בופר M9 מותאם (M9W), ואסוף את התולעים בצינורות חרוטיים של 15 מ"ל.
3. לשטוף את התולעים 3 פעמים.
4. הסר את רוב ה-M9W באמצעות שאיבה והוסף 500 מיקרולטר M9W המכיל 2 מילימטר נתרן אזיד או 2 מ"מ טטראמיזול הידרוכלוריד לכדור התולעת. זה ירדימו את התולעים, ויבטיחו שלא תתרחש תנועה בעת התמונה תחת המיקרוסקופ.
   זהירות: השתמש בציוד מגן אישי (PPE) בעת טיפול בנתרן אזיד. הכינו את תמיסת האזיד מתחת למכסה הכימי.
5. דגרו את כדורי התולעת בטמפרטורת החדר (RT) למשך 15 דקות. לאחר מכן, הניחו 15 מיקרוליטר של תליית התולעת על משטח אגרוז מוכן. הנח בעדינות כיסוי מס' 1.5 מעל כרית האגרוז המכילה את התולעים המורדמות.
6. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ניתן להמחיש את מיקום פקטור השעתוק 1 של משפחת סקינהד או SKN-1:GFP (Green Fluorescent Protein-Tagged SKN-1) באמצעות פילטרים פלואורסציאן איזותיוציאנאט (FITC) ו-4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI). תולעי תמונה בהגדלות פי 10 ו-20x.
7. לדרג את התולעים לפי רמת המיקום של SKN-1. אין מיקום גרעיני, מיקום של SKN-1B/C::GFP (GREEN Fluorescent Protein-Tagged SKN-1 isoform B/C) בחלק הקדמי או האחורי של התולעת, ומיקום גרעיני של SKN-1B/C::GFP בכל תאי המעי מסווגים כרמות נמוכות, בינוניות וגבוהות, בהתאמה.
8. לאחר צביעת המיקרוגרפים הפלואורסצנטיים, קבעו את ההבדלים הסטטיסטיים לפי חי-בריבוע ומבחני פישר המדויקים באמצעות תוכנה סטטיסטית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדיה וכימיקלים
מרק BD Bacto Todd Hewitt	פישר סיינטיפיק	DF0492-17-6
צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים קוניים בנפח 15 מ"ל	פישר סיינטיפיק	12-565-269
אזיד נתרן	סיגמא אולדריץ'	S2002-25G
טטראמיזול הידרוכלוריד	סיגמא אולדריץ'	L9756
מחליפות כיסוי מס' 1.5 בגודל 18 מ"מ x 18 מ"מ	פישר סיינטיפיק	12-541A
אגרוז	סיגמא אולדריץ'	A9539-50G
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + ROL-6(SU1006)	קית' בלקוול